视黄酸核受体β介导的atra对骨髓间充质干细胞成神经分化促进作用的实验研究

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1、重庆医科大学博士学位论文视黄酸核受体β介导的ATRA对骨髓间充质干细胞成神经分化促进作用的实验研究姓名：龚敏申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：李廷玉201205重庆医科大学博士研究生学位论文视黄酸核受体B介导的ATRA对骨髓间充质干细胞成神经分化促进作用的实验研究摘要第一部分全反式视黄酸对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响观察及诱导条件优化目的探讨不同浓度ATRA预诱导对rMSCs神经分化效率、细胞形态、分化成熟度、细胞增殖和凋亡、细胞功能方面的影响作用，以筛选ATRA最佳诱导浓度；并检测最佳浓度ATRA预

2、诱导对诱导后神经元样细胞神经相关标志物表达和神经细胞功能的影响；同时观察RA信号通路中关键受体RARs在ATRA预诱导促进rMSCs神经分化过程中的变化。方法采用全骨髓培养法分离培养rMSCs，并用流式细胞术鉴定rMSCs。采用0、O．01、0．1、1、10、1009M几个不同浓度对rMSCs进行预诱导，后续采用MNM神经诱导液进行神经分化诱导；计算rMSCs神经分化率，NikonElementsD软件测量分化后神经元样细胞胞体直径和轴突长度；胎盘蓝染色计算细胞死亡率、MTS检测神经元样细胞生长存活情况、Hoe

3、chst荧光染料观察神经元样细胞凋亡；Real．timePCR检测不同浓度ATRA预诱导时神经元标志物Nestin、NSE、MAP．2的表达情况。确定最佳ATRA预诱导浓度后，采用RT-PCR和免疫荧光重庆医科大学博士研究生学位论文检测不同处理组细胞神经元标志物Nestin、NSE、MAP．2和胶质细胞标志物GFAP、CD68、GDNF的表达情况；并用westernblotting检测ATRA预诱导rMSCs神经分化不同时间点Nestin和NSE蛋白表达的变化趋势；然后采用膜片钳和钙离子检测系统检测不同处理rM

4、SCs分化后神经元样细胞功能情况。最后，采用real．timePCR和免疫荧光检测不同处理诱导后细胞RA信号转导通路RARs表达情况。结果(1)rMSCs的分离培养、扩增和流式细胞鉴定：rMSCs呈梭形，漩涡状生长；流式细胞术鉴定发现99％以上的rMSCs表达CD29、CD44、CDl06和CD90，几乎不表达CD45和CD34。(2)不同浓度ATI认预诱导对rMSCs神经分化的作用：经MNM诱导后，rMSCs分化为双极或多极神经元细胞形态；ATRA浓度在O．01．109M范围内，ATRA浓度越高，神经样细胞分

5、化效率越高，神经元胞体直径越大，轴突更长(p

6、起成熟神经元表面标志的表达，仅神经干细胞Nestin的表达稍有增加；预诱导的rMSCs神经分化后Nestin、NSE及MAP．2神经元相关标志物表达更高，而GFAP、CD68胶质细胞标志物表达较未预诱导为低；免疫荧光也显示，预诱导的4重庆医科大学博士研究生学位论文rMSCs神经分化后Nestin、NSE及MAP．2神经元相关标志物表达更高，而胶质细胞相关标志物GDNF表达更低。ATRA预诱导+MNM神经诱导O．36小时，NSE的表达逐渐增高，而Nestin表达先增高，随后下降，于MNM诱导后18小时达顶峰。(4

7、)ATRA预诱导rMSCs神经分化所得神经元样细胞在功能上具有更大优势：静息膜电位显示，经A]限A预诱导后所得神经元样细胞较单独经MNM诱导的神经元样细胞有更大负值膜电位(p

8、Rl3最为明显；而仅经ATRA预诱导后rMSCs只有RARp表达上调；ATRA预诱导rMSCs神经分化后RARp上调比未经ATRA预诱导rMSCs神经分化后更高；另外，rMSCs神经分化后RARp还出现定位表达变化，向胞核周边聚集。结论(1)通过全骨髓培养我们成功获取了rMSCs细胞，并经流式细胞术鉴定。(2)rMSCs可以有效地被诱导为神经元样细胞，而且不仅是形态上和神经标志物上，还