葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究

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1、华中农业大学博士学位论文葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究姓名：吴明德申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：李国庆201206源于葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究摘要葡萄孢属真菌(Botrytisspp)是一种广泛分布的植物病原真菌，可引起多种作物的灰霉病，造成严重的经济损失。本研究对源于灰葡萄孢(且cinerea)、大蒜盲种葡萄孢(B．porri)、葱鳞葡萄孢(曰．squamosa)、中国葱葡萄孢(曰．sinoallii)及拟蚕豆葡萄孢(B．fabiopsis)中的5类真菌病毒进行了研究，具体包括两种线粒体病毒(Mitovirus)、一种双分病毒(Partiti

2、virus)、一种尚未分类的病毒及一个代表新病毒科的成员。在上述5种病毒中，有两种病毒己被证实与葡萄孢的致病力衰退有密切的关系，其中包括源于灰葡萄孢菌株CanBc．1的线粒体病毒Botrytiscmereamitovirus1(BcMvl)和源于大蒜盲种葡萄孢菌株GarlieBe-72的真菌病毒BotrytisporIiRNAvirus1(BpRVl)。BcMVl的全长约为2804nt，与OnuMV3b有极高的同源性，可以通过病菌的分生孢子进行垂直传染和通过菌丝的融合进行水平传染。成功传染BcMVldsRNA的菌株均会在生长速度和致病力上出现明显的衰退。通过透射电

3、镜对病毒感染后菌丝的超薄切片进行观察可以发现，病毒侵染后，菌丝细胞中线粒体会出现肿大、嵴退化和内部纤维化的症状，加之提纯的线粒体中也可检测到BcMVl的dsRNA，因此，BcMVl的攻击位点被认为是线粒体。BcMVl侵染线粒体后，造成线粒体的超微结构出现明显的异常，从而可能造成线粒体功能的紊乱，并最终导致灰葡萄孢致病力的严重衰退。此外，BcMVl在灰葡萄孢分生孢子形成过程中可以产生DIRNA，即BcMVl．S。BcMVl．S可以通过菌丝融合进行水平传染。虽然它可以抑制BcMVl的复制但不会影响BcMVl造成的弱毒特性。BpRVl是本研究中另一种可引起葡萄孢致病力衰

4、退的真菌病毒。BpRVl的基因组含有两条dsRNA片段，分别命名为dsRNA-1(6125bp)和dsRNA-2(5879bp)。这两条片段在5’和3’末端分别有95％和62％的相似度，且各编码一个大的开放阅读框(ORF)，分别命名为ORFI(dsRNA-1)和ORFII(dsRNA-2)。ORFI所编码的蛋白在靠近N端的区域与Totiviridae、Chrysoviridae和Megabirnaviridae科病毒所编码的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)有一定的同源性，且同源性约为19％一23％。ORFI所编码蛋白的其他区域及ORFII所编码蛋白并未在数据

5、库中搜索到与之有明显同源性的蛋白序列。系统进化分析表明，BpRVl属于一个单独的分华中农业大学2012届博士研究生学位论文支，与已报道真菌病毒的亲缘关系均较远。BpRVl的病毒粒体直径约为35nln，里面包含有两条dsRNA链(dsRNA-1和dsRNA．2)和大小分别为70kDa、80ma及85kDa的三种病毒结构蛋白。蛋白质指纹图谱分析表明80kD极85kDa的结构蛋白由dsRNA．1编码，而70kDa的结构蛋白由dsRNA．2编码。将BpRVl的病毒粒体导入强毒菌株GarlieBc．38后，会导致其病毒感染后的衍生菌株38T致病力和生长速度的衰退。以上结果都

6、表明，BpRVl是一种新型的真菌病毒，并可能属于一个新的病毒科。此外，在葱鳞葡萄孢菌株LeekBc．10中也检测到了一种真菌病毒，BotrytissquamosaRNAvii'us1(BsRVl)。BsRVl与BpRVl的两条dsRNA基因组在核酸水平上的同源性为91％．97％，而在蛋白水平上的同源性则高达97％．98％，因此BpRVl与BsRVl被认为是同一种病毒的不同毒株。剩余的3种真菌病毒对寄主的影响尚不十分明确，但病毒侵染的菌株都表现出了与正常菌株明显不同的培养形态。其中，已获得了来源于葱鳞葡萄孢菌株GarlicBc．21的Botrytissquamosa

7、RNAvirus2(BsRV2／Be．21)和来源于拟蚕豆葡萄孢菌株BroadbeanBc．41的BotrytisfabiopsisRNAvirus1(BfRVl／Be．41)部分基因组序列。结果显示两者在蛋白水平上有91％以上的相似性，因而BsRV2／Bc．21与BfRVl／Bc-41可能也是同一种病毒。系统进化分析表明这两种病毒与FgV．DK21的亲缘关系最近，且与hypovirus有一定的亲缘关系，但具体的分类地位还尚待确定。另外在菌株BroadbeanBe．41中还发现了一种双分病毒Botrytisfabiopsispartifivirus1(BfPVl)

8、与SsPV