肠出血性大肠埃希菌o157h7 lamp检测方法的建立及嗜酸乳杆菌食品级表达系统的构建

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文出血性大肠埃希菌0157：H7LAMP检测方法的建立及嗜酸乳杆菌食品级表达系统的构建DevelopmentofLAMPassayfordetectionofEnterohemorrhagicElcoil0157：H7andconstructionofL．acidophilusfood—gradedsystem课题来源：广州市科技计划重大专项2010U1一E00611专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病原生物学姜容龙北国教授江丽芳教授彭涛教授周荣教授黎诚耀教授芮勇宇

2、教授论文评阅人吴清平教授陈清教授2012年5月l5日硕士学位论文出血性大肠埃希菌O157：H7LAMP检测方法的建立及嗜酸乳杆菌食品级表达系统的构建硕士研究生：姜容指导老师：龙北国教授摘要一、研究背景和目的肠出血性大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)0157：H7是一种新型的食源性致病菌，主要经食品传播，引起食物中毒，临床主要表现为出血性肠炎(hemorrhagiccolitis，HC)，以及血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthromobocytopen

3、ieporpura，TTP)和溶血性尿毒综合症(hemolyticuremicsyndrome，HUS)等。自1982年美国首次暴发EHEC0157：H7感染后，世界各地相继出现散发和暴发性流行性病例，致病性和致死性较高。1986年，我国首次从出血性结肠炎患者中分离到EHEC0157：H7。目前，已有10多个省份从食品、家禽家畜和腹泻患者粪便中分离到EHEC0157：H7。EHEC0157：H7严重威胁到社会公共卫生和人类健康。因此，快速检测和有效防治EHEC0157：H7感染一直是国内外学者关注的一大难题。传统的分

4、离培养法成本低，被广泛接受，但需分离培养、生化和血清学鉴定等，较为费时。PCR技术是近年来快速检测EHEC0157：H7的方法，但需要特殊的仪器，检测成本高，在特异性、简便性等方面存在不足【51。因此，建立一种快速、简便、准确的检测方法，对EHEC0157：H7感染的流行病学调查和防治工作十分重要。环介导等温扩增(100p．mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本学中文摘要者Notomi等建立的一种新的核酸等温扩增技术，其原理是，针对靶基因的6或8个区域设计4或6种特异性引物，

5、利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等温条件(约65"(2)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP能够高效、快速、灵敏、特异地扩增靶DNA，操作简便，成本低，适于大规模样品的检测和基层单位推广应用，现已广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测以及动物胚胎的性别鉴定等。本研究以EHEC0157：H7的rfl,E基因(GenBank：$83460．1)为靶序列，运用在线引物设计软件PrimerExplorer4．0设计LAMP引物，对各扩增条件进行优化，建立LAMP反应体系。同时进行PCR检测

6、，比较这两种方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果，以证实LAMP的现实可行性。针对EHEC0157：H7感染，目前临床上主要以预防和支持疗法为主，尚缺乏特效的治疗药物。采用抗生素疗法，可能导致EHEC0157：H7的细胞壁溶解，促进致死性志贺毒素(Shigatoxin，Stx)的释放，加剧患者并发溶血性尿毒综合症的危险性。可见，研制出安全、有效的疫苗，对预防EHEC0157：H7感染具有重要意义。目前，国内外对EHEC0157：H7的疫苗研究主要集中在多糖结合疫苗、细菌ghost疫苗、基因工程亚单位疫苗、转基因

7、植物疫苗和Stx类毒素疫苗等，虽然取得一定的进展，有的已进入临床实验，但也存在一些缺陷。迄今为止，尚无理想的疫苗推广应用。近年来，乳酸菌(Lacticacidbacteria)作为载体表达和传递目的抗原的研究备受关注。该菌安全、无毒，被公认为安全级微生物(GRAS，generalyrecognizeassafe)。随着乳酸菌各类表达调控元件的分离，相继发展了一系列适用于乳酸菌的克隆载体、表达载体、整合载体，而乳酸菌食品级高效表达系统的构建及应用则是该领域研究的前沿和热点。因此，本研究拟构建食品级嗜酸乳杆菌表达系统，作

8、为EHEC0157：H7活载体疫苗的抗原投递系统，添加至动物饲料中以免疫动物，从源头上控制EHEC0157：H7感染，保证食品安全。在EHEC0157：H7感染暴发流行期间，免疫易感人群，有效控制疾病的蔓延。乳酸菌食品级表达系统必须具备以下条件：l、载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段，主要是抗生素编码基因；2、表达宿主必须是Ⅱ