着丝粒蛋白-e野生型基因沉默对人结肠癌细胞hct116的生物学作用研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文着丝粒蛋白--E野生型基因沉默对人结肠癌细胞HCT116的生物学作用研究姓名：章帆申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：翁亚光201205重庆医科大学硕士研究生学位论文着丝粒蛋白．E野生型基因沉默对人结肠癌细胞HCTll6的生物学作用研究摘要目的：利用RNA干扰技术下调着丝粒蛋白E野生型(wildWpecen仃omereprotemE，CENP—EWT)基因的表达，观察其对结肠癌HCTl16细胞的生物学作用。方法：将细胞分为以下3组：空白对照组、空载体组、实验组(即转染CENP．EWTshRNA组)。用针对CENP．EWT特异

2、靶点的shRNA转染结肠癌细胞HCTI16，运用巢式PCR检测mRNA水平的变化；MTT检测细胞增殖的影响：Hoechst法检测细胞凋亡的变化；Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。设计并合成针对着丝粒蛋白E缺失型(VarianttypeCen订omereproteinE，CENP—EI)基因特异性的6对siRNA干扰序列，将前期实验中能有效干扰着丝粒蛋白E野生型基因的干扰序列同时合成，通过分子克隆技术，分别7对序列克隆入pSES—HUS腺病毒穿梭质粒，构建重组质粒。结果：与空白对照组和空质粒组相比，转染了CENP．EWTshRNA组可有效的抑制

3、CENP-EWT基因的表达(P

4、T基因的表达，抑制细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，但同时能增强细胞的迁移和侵袭能力。关键词：RNA干扰；CENP．EWT；HCTll6细胞；结肠癌；迁移4EFFECTSOFCENP—EWTGENESILENCINGONHUMANCOLONCANCERCELLLINEHCTl6ABSTRACTObjective：Toexploretheeffectofdown—regulatingwildtypecentromereproteinE(CENP-EWT)expressionbyRNAinterferenceonhumancoloncancercelllineHCTl1

5、6．Methods：HCTl16cellsweredividedintothreegroups：blankcontrolgroup，emptyvectorgroup(transfectedwithanemptyvector)，andexperimentgroup(transfectedwithCENP—EWTshRNA)．AfterHCTI16cellstransfectedwithCENP-EWTshRNA，themRNAexpressionofCENP-EWTwasexaminedbyNestedPCR；cellproliferationwasevalua

6、tedbyMTTassay；cellapoptosiswasdetectedbyHoechstassay；cellmigrationandinvasionweredetectedbyTranswellassay．DesignedandsynthesizedforcentromereproteinEdeletion(VarianttypeCentromereproteinE，CENP—EI)genespecificsixpairsofsiRNAinterferencesequence，whilepreviousexperimentscaneffectivelyi

7、nterferewithwild-typegenesequenceoftheinterferenceofthecentromereproteinEsequencesynthesis，usingmolecularcloningtechniqueswereclonedintopSES—HUSadenovirusshuttleplasmid，therecombinantplasmid．5重庆医科大学硕士研究生学位论文Results：Comparedwithcellsoftheblankcontrolandnegativecontrolgroup，theexpress

8、ionofCENP—EWTmRNA(p