猪圆环病毒诊断及含cpg基序核酸疫苗对小鼠的免疫作用研究

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1、DiagnosisofporcinecircovirusandexperimentofDNAvaccinewRhCpG7一‘esissubmittedt01hesIsQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmemoftheRequiremeritfortheDegreeofMasterofAgronomYWuXiaoyan(DepartmentofPreventiveveterinary)Supervisor：WangJinbao，Qingdao．ChinaJune，2012独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研

2、究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：亲鼢热＼时间：■，>年莎月>b日，关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部

3、分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：蒙嘲迭、时间：v陋年∥月>召日导师签名：时间：年月日猪圆环病毒诊断及含CpG基序核酸疫苗对小鼠的免疫作用研究摘要猪圆环病毒(Porcineeireovirus，PCV)属于圆环病毒科，是一种小的、无囊膜的单链负股环状DNA病毒。圆环病毒共有2个基因型，分别为无致病性的PCVl和有致病性的PCV2。PCV2病毒粒子侵入机体后可引起B淋巴细胞凋亡，导致机体免疫力下降，给世界养猪业带来了巨大的威胁。针对PCV2的鉴定和检测已有许多方法，如ELISA、IFA、PCR等，但是这些方法过程繁琐、耗时较长或者人为操作误差较

4、大。而荧光定量PCR：．JL术具有快速、灵敏、高特异性等特点，因此被越来越多的应用于各种病毒的检测。本研究利用普通PcR技术扩增PCV2的ORF2基因702bp片段，并克隆到pVAXl载体，以纯化的质粒作为PCR检测的标准模板，以10倍梯度稀释质粒为阳性标准品，摸索荧光定量PCR试验，并绘制标准曲线，以此建立一种荧光定量PCrt#争异性检测猪圆环病毒的方法。结果表明，该方法对PCV2有很好的特异性，其敏感性比常栅CR高100倍，批间与批内重复试验变异系数均小于2．5％。经临床应用表明荧光定量PCR方法的建立实现了对PCV2特异性的快速诊断乖定量检测。在利用猪肾脏细胞

5、(PK．15)培养PCV：病毒中很容易污染无致病性的PCVl，给PCV2的纯化与培养带来困难。本研究还建立了一种多重荧光定量PCI凇测技术以快速区分PCVl和PCV2。本研究设计了3条引物，其中D1是PCVl和PCV2共享引物。结果表明，PCVl和PCV2扩增产物的熔解温度(Tm)分别为84．5±O．20℃和86．6±0．03℃，可以根据熔解峰的不同来区分。反应的灵敏度分别可达到1×101拷贝旭和1×102拷贝地，且与PRV、PRRSV和PPv无交叉反应．此方法为监控细胞毒的纯化培养提供了简便快捷的方法。为了研究含CpG基序的核酸疫苗在小鼠体内的免疫作用，将40只6

6、周龄Balb／c小鼠随机分为四组，其中：A组是PBS对照组，B组是pVAXl空载体组，C组是pVAXl。ORF2疫苗组，D组是18CpG-pVAXl．ORF2．疫苗组。各组均采用肌肉注射，每次200rtL，疫苗有效成分含量1001．tg，2周后按相同途径和剂量进行第二次免疫，二免后4周用0．2mL的PCV2SD株细胞培养物(106一TCID50／“)接种小鼠，检测抗体变化情况并进行病理组织学观察。试验结果表明，注射疫苗后各组小鼠没有明显症状，攻毒后A、B组小鼠呈现微观剖检病变，疫苗组无病变。核酸疫苗pVAXl．ORF2和18CpG-pVAXl．ORF2均有一定的免疫

7、刺激作用，但18CpG-pVAXl．ORF2组在免疫后抗体水平明显升高，而且二免后2周S／P值达到最高值0．4340，抗体水平下降缓慢，攻毒后抗体水平迅速升高，且作用持久。攻毒后荧光定量PCR结果显示小鼠脏器中出现病毒复制，但是疫苗组能够逐渐清除病毒。因此含有18个CpG的核酸疫苗在小鼠身上起到较好免疫保护作用。关键词：荧光定量PCR；鉴别诊断；CpG基序；核酸疫苗n●·—■●-●111·』Dla星mosisolDorcmeCIFCovIrusann哪enmentofDNAvacc'mewithCpGmotifsinmicePorcineeircovirus6,