棒曲霉素引起hek-293细胞dna损伤的溶酶体途径

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1、棒曲霉素引起HEK一293细胞DNA损伤的溶酶体途径计：学位论文：31页表格：2个插图：6幅徐源指导教师：刘晓芳教授申请学位级别：硕士学位专业名称：劳动卫生与环境卫生学论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的

2、同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：趣签字目期：超监年—￡月堕日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯气二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯气(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(三)结果00DIOQ0QO080D0D0ODOQOUO0aOD0DOraDO8(四

3、)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31棒曲霉素引起HEK-293细胞DNA损伤的溶酶体途径硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：徐源刘晓芳副教授仲来福教授刘晓芳副教授劳

4、动卫生与环境卫生学摘要目的：棒曲霉素(Patulin，PAT)，又称为展青霉素，属于真菌毒素类，主要是曲霉属、青霉属、裸囊菌属等真菌的次生代谢产物。棒曲霉素在1940年第一次被分离出来，经过多年的研究，在近些年人们逐渐认识到这种棒曲霉素是存在于苹果和苹果产品中的毒素，并成为全球广泛关注的霉素。国际癌症研究中心(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)将PAT对人类的致癌性列为第三类。世界卫生组织(WHO)规定了食品中棒曲霉素的最高限量为5099／L，而目前欧盟已有更严格要求的趋势，5099／kg为棒曲霉素残

5、留限定量，对婴幼儿食品内含量限定为1099／kg体重。棒曲霉素经过毒理学试验证明其能使动物畸变、突变和癌变。研究还表明PAT还有遗传毒性和免疫毒性。有研究显示PAT的遗传毒性与细胞的氧化应激有关。近期研究证明了DNA的损伤与溶酶体膜稳定性改变也有关系。因此，我们研究了棒曲霉素引起的DNA损伤与细胞内ROS水平以及溶酶体的关系，旨在探讨PAT遗传毒性的机制。本研究选用人胚‘肾HEK．293细胞，探讨棒曲霉素的DNA损害作用可能机制，为进一步评估PAT对人类的健康危害提供实验资料。方法：以HEK．293细胞作为试验系统。通过MTT试验检测PAT对HEK．29

6、3细胞毒性大小，通过单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测细胞DNA损伤情况，评价PAT遗传毒性。为探讨其可能的遗传毒性机制，用DCFH法检测细胞内ROS水平，用吖啶橙(Acridineorange)测定细胞内溶酶体膜稳定性；采用N一乙酰半胱氨酸(NAC)和氯化铵(NH4CL)对溶酶体进行保护干预；分别采用NAC、NH4CL、抑胃肽(pepstatinA)干预PAT所致的DNA损伤。实验结果用SPSSvl1．5统计软件进行统计分析。结果：5-209M的PAT作用于HEK一293细胞1h后，引起细胞DNA链断裂，细胞形成彗星样拖尾，其尾长、尾矩和尾百分含量与P

7、AT呈剂量依赖关系；2．5．409M的PAT作用于HEK．293细胞1h后引起细胞内溶酶体膜稳定性发生改变，809M的PAT作用1h后引起ROS水平增加。用10mM的NH4CL、500mM的NAC预处理HEK．293细胞1h后，都明显保护了细胞内溶酶体膜稳定性。分别用10mM的NH4CL、500mM的NAC和1009M的pepstatinA预处理HEK．293细胞1h后，PAT引起的DNA链断裂几乎完全被阻止。但用309M的地昔帕明预处理后，PAT引起的DNA链断裂没有得到明显改善，可能与单独地昔帕明弓}起了HKE．293细胞DNA损伤有关。结论：棒曲霉

8、素可致HEK．293细胞DNA链断裂，其作用机制可能与溶酶体途径有关，通过溶酶体