微血管损伤的靶向超声造影剂制备及其黏附效能的实验研究

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1、新乡医学院硕士学位论文微血管损伤的靶向超声造影剂制备及其黏附效能的实验研究姓名：王朝清申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：马方201203新乡医学院硕士学位论文微血管损伤的靶向超声造影剂制备及其黏附效能的实验研究研究生：王朝清指导教师：马方教授摘要目的1．探讨靶向超声造影剂的构建方法及其构建过程对超声造影剂微泡物理性质的影响，为构建靶向化超声造影剂提供实验方法学；2．建立葡萄糖损伤的血管内细胞模型，为验证靶向微泡造影剂的黏附能力提供实验平台并为糖尿病血管病变早期诊断的进一步研究提供实验基础；3．应用平板流动腔技

2、术检测靶向超声微泡对特异性靶细胞的黏附能力，为下一步应用靶向化微泡进行糖尿病早期微血管病变的特异性诊断提供可靠的实验依据。方法1．应用生物素．链霉亲和素连接系统，使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)与特异性抗血管细胞黏附分子。1(VCAM一1)抗体连接，用间接免疫荧光法检测抗体与微泡的连接，用马尔文激光粒径分析仪分别测定生物素化处理前后微泡的粒径，采用超声诊断仪评价微泡靶向化构建前后的显像效果。2．传代培养人主动脉血管内皮细胞(HAEc)至3、4代，选取细胞生长良好的细胞备用，选取葡萄糖浓度为5．5mm01／l、

3、7．7mmol／l、11．6Imnol／l、17．7mmol／1、21．8mmol／l、30mmol／l的细胞培养液分别干预细胞3h、6h、12h、24h，干预结束后应用FITC标记的鼠抗人VCAM一1抗体及鼠抗人TM抗体直接标记细胞膜表面抗原，流式细胞仪检测细胞携带FITC抗体的细胞阳性率，进行统计学分析处理，筛选最佳葡糖糖干预浓度和时间。3．将3、4代HAEC种植于20mm的圆形盖玻片上培养，待细胞生长融合达到90％以上时应用葡萄糖浓度为16．7nHnol／l的培养液干预细胞6h，干预结束后将盖玻片置于平行板流

4、动腔装置内，连接通路，使平行板板流动腔内充满微泡混悬液，细胞与混悬液充分结合，调节液体流速，观察流速调节前后视野内的微泡数量，计算微泡的黏附率，进行统计学分析。结果1．sonovue与特异性抗体通过生物素．链霉亲和素系统成功连接，间接免疫荧光检测呈阳性。生物素修饰后的微泡粒径分布变窄，与普通微泡的超声显像效新乡医学院硕士学位论文果略有差异。2．人主动脉血管内皮细胞膜表面VCAM．1的表达随细胞培养液的葡萄糖浓度增高而增高，至16．7mm01／l时达峰值，之后随葡萄糖浓度升高而降低；同时VCAM．1的表达随葡萄糖作用

5、时间延长而增高，至6h时达峰值，之后随葡萄糖作用时间延长而降低。人主动脉血管内皮细胞TM的表达趋势与VCAM．1相似，在葡萄糖浓度为16．7mmol／l、作用时间为3h时达峰值。3．经葡萄糖损伤的细胞周围黏附的靶向微泡数量多于普通微泡；正常细胞周围黏附的两种微泡均较少。普通微泡、靶向微泡与细胞的黏附率随剪切力的增加而逐渐下降，靶向微泡在相同剪切力条件下黏附率高于普通微泡，差异有统计学意义。结论1．通过生物素．链霉亲和素系统可以成功构建靶向化超声微泡，靶向化处理因素对微泡的粒径有一定的影响，对微泡的超声显像效果略有影

6、响。2．通过葡萄糖刺激人主动脉血管内皮细胞可成功构建血管内皮细胞的损伤模型，为糖尿病血管病变研究提供实验基础。3．平行板流动腔技术可以用于评价靶向微泡的特异性黏附能力，是一种理想的检测微泡靶向化构建效果的工具；靶向微泡与靶细胞可以特异性结合且具有较强的黏附能力，在临床的特异性诊断方面具有潜在的应用价值。关键词靶向超声微泡；人主动脉血管内皮细胞；血管细胞黏附分子．1；血栓调节蛋白；平行板流动腔2新乡医学院硕士学位论文PreparationofAcousticContrastAgent7rargetedtoMicroa

7、ngiopathyanditsEmcacyofAdhesionto1'argetedCells】，0st-graduate，WangChaoqingSupervisorofpostgraduate，TⅥaFangSUpen，lS0r0tp0St2radUate．』VIa量i’an2Abstractobjec小，e1．TbinVestigatetllepr印arationmethodsoftargetedantibodycoImectingtomicro-bubbles，a11dtoeValuatetheimpact

8、ofta鸩etingonthephySicalpropertiesofmicro-bu．bbles．2．7roestablishhllmajlaorticendothelialcells(HAEC)modelinjuredby百ucoseproVideta玛etedcellssoastoeValuatingtheadhesionemcacyofmeta玛et