乳腺癌中ibp的转录调控机制及其意义的初步研究

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1、第三军医大学博士学位论文乳腺癌中IBP的转录调控机制及其意义的初步研究姓名：杨明珍申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：胡川闽2012-11第三军医大学博士学位论文乳腺癌中IBP的转录调控机制及其意义的初步研究摘要乳腺癌是目前为止女性中发病率最高的肿瘤，早在2002年世界卫生组织就统计出1．15亿的乳腺癌患者。在中国，乳腺癌的发病率以每年3％到4％的速度增加。尽管人们在乳腺癌的分子机制和早期诊断方面已有不小的进步，但是仍有30％的早期乳腺癌病人经治疗后出现复发。寻找新的乳腺癌诊治的靶点

2、是目前亟待解决的问题之一。干扰素调节因子一4结合蛋f刍(Interferonregulatoryfactor4-bindingprotein，rap)作为鸟苷酸交换因子家族分子(guaninenucleotideexchangefactor，GEF)，在免疫系统中具有重要作用：参与免疫突触的形成，与Th2细胞极化相关，等等。2009年我实验室首次发现IBP在正常乳腺上皮中不表达，而高表达于肿瘤上皮中，并发现其与乳腺癌的分级分期、转移等相关。这提示IBP的转录调控机制可能与乳腺癌的发生、发展相关，

3、同时提示IBP在乳腺癌中可能具有新的更为重要的功能。然而，目前关于IBP的转录调控机制尚不十分清楚，IBP在乳腺癌中的信号调节网络以及分子功能还有待进一步研究。本课题对IBP在乳腺癌中的异常表达的转录调控机制进行了研究，并通过体外实验初步探讨了IBP在乳腺癌治疗中的意义及其相关机制，研究主要从以下几个方面进行：1．人／BP基因启动子的生物信息学预测及活性分析(1)将不同长度的佃P5’侧翼序列分别克隆入萤光素酶表达载体，并转染HEK293细胞，利用报告基因检测系统，证实佃尸核心启动子区域位于一29

4、4到一115的区域。(2)利用PROMO程序生物信息学分析发现，在该核心启动子区域具有一个潜在的非经典的p53结合位点。2．野生型p53蛋白对馏P启动子活性及其表达的调控作用(1)将含有预测p53结合位点的并具有最强转录活性的佃P启动子报告基因质粒(pIV)，分别转染HCTll6p53。和HCTll6p53“+(野生型p53表达)细胞株，发现在p53缺失的HCTll6细胞中该片段具有更强的启动子活性。(2)将plV转染p53抑制的乳腺癌细胞株MCF一7及其对照细胞株，发现内源性p53抑制后佃P的

5、启动子活性增强。(3)利用p53激活剂阿霉素刺激MCF一7细胞，并检测转染的plV活性，结果阿霉7第三军医大学博L学位论文素可以降低佃P的启动子活性。(4)p53真核表达质粒及其突变质粒p53R175H分别与plV共转染HCTl16p53乒，结果表明野生型p53调节佃P启动子的活性，而p53R175H不影响佃P启动子活性。(5)将p53腺病毒感染HCTl16p534细胞，并分别转染佃P启动子报告基因质粒及p53结合位点突变的报告基因质粒，结果表明p53通过预测的p53结合位点调节佃P启动子活性。

6、(6)分别利用定量PCR和WesternBlot检测p53腺病毒感染、p53干扰慢病毒感染以及p53抑制剂pifithrin．Ⅱ、激活剂Nutlin一3刺激的MCF一7细胞中IBP的表达情况，结果表明乳腺癌细胞株中IBP表达与p53表达直接相关，IBP是p53的应答基因。3．体内外实验鉴定野生型p53蛋白与佃P启动子的结合(1)细胞外，采用MCF一7、HCTll6p53“+和HCTll6p53。核蛋白，利用电泳迁移率转变实验(electrophoresismobilityshiftassay，E

7、MSA)，结合p21探针竞争实验以及p53抗体超位移实验，证明在体外野生型p53蛋白可以与估P启动子序列结合。(2)结合p53激活剂阿霉素刺激，利用染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay'CHIP)，在MCF一7和HCT16p53卅+细胞内证明p53可以和／BP启动子区域结合。4．DNA损伤药物以p53依赖的方式调节IBP的表达(1)利用WesternBlot在野生型p53表达乳腺癌细胞株MCF一7和ZR一75—1中证明DNA损伤药物顺铂、阿霉素

8、以剂量、时间依赖的方式抑制IBP的表达。(2)在HCTll6p53乒和p53表达抑制的MCF一7细胞中，WesternBlot检测发现顺铂不能抑制IBP的表达，说明DNA损伤药物在乳腺癌中以p53依赖的方式抑制IBP的表达。5．乳腺癌中IBP调节顺铂诱导的细胞凋亡(1)建立稳定的IBP过表达以及IBP表达抑制的MCF一7细胞株，分别检测顺铂对各细胞的增殖抑制作用，计算半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration，IC50)，结果表明IBP可以降低乳腺癌细胞株对顺铂的敏感性。