pvax1sjscfv-il18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其机制的研究

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1、分类号VDC博士学位论文密级pVAXl／跏cFv—IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其机制的研究StudyontheeffectandmechanismofpVAX1母scFV扎l8ameliorateshepatic袖rosisinschistosomiasisjaponica作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：田智病原生物学基础医学院汪世平教授敝答辩聃趁竺埠艘里答辩委始主席堕竺L中南大学二零一二年六月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了

2、论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：豆砭盔．日期：趔兰年』月卫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位

3、论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：蛆聊签名巨刍日期：丝“月丝日博士学位论文中文摘要摘要研究背景血吸虫病(scKstosoIIliasis)是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病，我国是日本血吸虫病(scllistosomiasis．j叩onica)流行最严重的四个国家之一。日本血吸虫(＆办西幻so聊口冲D刀把“朋，$)致病的主要原因是雌虫产出的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中，形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化。肝纤维化的进一步发展导致肝硬化

4、，患者可因上消化道出血、肝性昏迷等严重并发症而致死。因此，阻止虫卵肉芽肿病变的形成，对于控制日本血吸虫病的进程、防止晚期血吸虫病的发生具有重要的意义。目前，临床上采用单一的吡喹酮治疗血吸虫病仍存在一定缺陷，吡喹酮只能杀灭童虫和成虫，而不能阻止肝组织内的虫卵继续分泌抗原，虫卵可溶性抗原(solublematuredeggam蟾en，SEA)可引起组织内虫卵肉芽肿反应，由于血吸虫病患者发现时多已转为慢性，肝组织内虫卵已经或正在形成虫卵肉芽肿或肝纤维化，有效杀虫治疗后病人依然有转化为晚期的可能，SEA诱导产生的免疫病理反应

5、并不因杀虫治疗而终止。IL．18是目前已知的对血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的细胞因子，然而单纯使用细胞因子治疗需连续、大剂量的用药，势必导致毒副作用的增加以及宿主体内细胞因子的严重失衡。本研究由国家科技支撑计划(2009B砧78805)、湖南省血吸虫病免疫与传播控制重点实验室、湖南省重点学科建设专项经费(No．07．985．2)联合资助博士学位论文中文摘要因此，我们拟利用实验室前期筛选得到的对日本血吸虫雌虫、未成熟虫卵、成熟虫卵等多个阶段均具有高特异性免疫靶向作用及识别能力的单链抗体(影single—chaillFv

6、ancibody，$scFv)，将其与对血吸虫性肝纤维化具有治疗作用的细胞因子IL．18融合表达，产生影scFv．ILl8融合蛋白，借助影scFv的免疫及靶向作用携带IL．18进入虫卵肉芽肿和肝纤维化形成的局部，特异性提高局部免疫作用及IL．18浓度，诱导日本血吸虫感染慢性期从T112型免疫应答转化为Thl型优势的免疫应答，同时能够极大地降低IL—18对其它正常组织器官的毒副作用，以期达到更好的抗日本血吸虫性病纤维化的效果。研究目的构建真核重组质粒pⅥ议1僻scFv—ILl8，转染巨噬细胞后，使用SEA刺激后的巨噬细

7、胞上清液处理肝星状细胞(HSCs)，观察对HSCs激活、增殖和凋亡的影响，并检测HSCs中与细胞外基质(ECM)沉积相关的基因表达，评估其抗肝纤维化的能力；并在日本血吸虫病肝纤维化小鼠中研究其对虫卵肉芽肿及肝纤维化形成的影响及其作用机制。研究方法1、真核重组质粒pVAXl／影scFV-ILl8的构建；采用SOE-PCR技术构建重组质粒pⅥ气X1何scFv-ILl8和pWⅨ1／$scFv，转化大肠杆菌后，进行大量表达，并通过双酶切和测序鉴定，使用生物信息学方法分析其结构特征。2、pⅥ埙l四scFv-ILl8对HSCs胶

8、原生成与降解的影响TT博士学位论文中文摘要将各组重组真核质粒转染巨噬细胞后，采用SEA刺激巨噬细胞后的上清液处理HSCs，应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测胶原相关基因n水NA水平、MTT检测HSCs细胞增殖、流式细胞术检测HSCs凋亡。3、pVAXl倚scFV-ILl8对日本血吸虫病肝纤维化的影响建立日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型，将pⅥⅨ