prrsv不同素株感染marc-145细胞的蛋白质组学分析及zcyz株感染性克隆的拯救

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1、山东农业大学博士学位论文PRRSV不同素株感染MARC--145细胞的蛋白质组学分析及ZCYZ株感染性克隆的拯救姓名：刘少宁申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：王金宝；姜世金20120611山东农业大学博I：学位论文中文摘要猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种病毒性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。在体内，PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcinealveolarmacrophage

2、s，PAM)；在体外，主要感染非洲绿猴肾细胞系MA．104及其衍生物MARC．145细胞。为了深入了解PRRSV感染后宿主细胞的反应以及不同毒株之间致病性的差异，本论文进行了以下研究：本研究首先对三株PRRSV(SDl株、SX．1株和ZCYZ株)的致病性进行了分析，通过序列比对及动物实验表明：SDl株为传统毒株，Nsp2没有缺失；SX．1株为高致病性毒株，Nsp2缺失30个氨基酸；ZCYZ株为从野猪中分离得到的高致病性毒株，Nsp2缺失了54个氨基酸，毒力介于SDl和SX．1之间。分别用SDl株、SX．1株和ZCYZ株感染MARC．145细胞，于感染后

3、48h收取细胞样本，运用iTRAQ技术(同位素相对标记与绝对定量技术)结合质谱鉴定(MALDI．TOFMS／MS)的方法分析不同致病性PRRSV毒株感染MARC．145细胞后相关蛋白表达的差异。结果三组(SDIVSMARC．145；SX．1vsMARC．145；ZCYZVSMARC．145)总共鉴定了233个差异蛋白，这些蛋白可以归结为与形态相关，与蛋白的合成及代谢相关，与热应激反应相关以及与泛素蛋白酶体通路相关。对鉴定到的差异蛋白进行Pathway分析，筛选出显著的、准确的、靶向的Pathway(Pathway．Analysis)。基于这些差异表达的

4、蛋白，我们构建了蛋白与蛋白之间的信号转导网络，研究蛋白间的信号转导过程，并从网络中找到起信号中枢的核心蛋白(Signal．Net)，而后对这三组数据中都存在的差异蛋白HSPA8的上调和ANXA2的下调用Western．blot的方法进行了验证。PRRSVZCYZ株分离自我国杂交的野猪群，该品种拥有75％的野猪血统和25％的杜洛克家猪血统。杂交的野猪能够稳定遗传并在外型上保留了野猪的特征。除此之外，它们脂肪含量较低，对外周环境有较强的适应能力。为了进一步阐述ZCYZ株的遗传特征及Nsp2处缺失的54个氨基酸对病毒致病力的影响，我们对其全基因进行了测序分析

5、，并构建了感染性eDNA克隆。间接免疫荧光实验证实了感染性克隆被成功拯救。动物实验表明拯救的克隆化病毒相对于母本毒株毒力与致病力而言较弱，这也为研制基因标记PRRSV1i同毒株感染MARC．145细胞的蛋白质组学分析及ZCYZ株感染性克隆的拯救疫苗以区分野毒感染提供了一个好的平台。本研究为深入探讨PRRSV的分子致病机制和毒力相关蛋白提供了科学线索和新的思路。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；蛋白质组学；信号通路；iTRAQ；感染性克隆山东农业火学博J二学位论文ProteomeprofilingofPRRSV-infectedMARC·-145cells

6、andtherescureofZCYZinfectiouscloneAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isaviraldiseasecausedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)．PRRSVmainlyleadstoreproductivedisorderinSOWSandrespiratoryproblemsinpigsofallages．ThepigsinfectedbyPRRSValsoshowi

7、mmnosuppresionandpersistentinfection．／nvivo，PRRSVmainlyinfectsporcinealveolarmarcophages，however'itcallreplicateintheAfricangreenmonkeykidneycellsMA104andderivedMARC-145／nvitro．Tobenerunderstandthehostresponsetoviralinfectionandthepathogenicdifferenceofdifferentstrains，wefirstan

8、alyzedthepathogenicofthreePRRSVstrains(SD1，SX-1