表达绿色荧光蛋白的北美ⅱ型prrsv感染性克隆的制备及特性分析

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文表达绿色荧光蛋白的北美II型PRRSV感染性克隆的制备及特性分析学位申请人：王利月指导教师：仲飞教授学科专业：基础兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十七日分类号：S852.65单位代码：10086密级：公开学号：2012352表达绿色荧光蛋白的北美Ⅱ型PRRSV感染性克隆的制备及特性分析PreparationandCharacterizationofNorthAmericanTypeII

2、PRRSVInfectiousCloneExpressingGreenFluorescentProtein学位申请人：王利月指导教师：仲飞教授学科专业：基础兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十七日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写讨的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料_与我.1同工作的同志对本研究

3、所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：糾玛签字日期：办口年6月5日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权、河j匕农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：土利同导师签名：fD签字曰期：年6月>日签字日期：沙6年/

4、月<日学位论文作者毕业后去向:工作单位：电话:通讯地址：邮编:摘要【目的】由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），一直是危害养猪业最为严重的传染病之一，给国内外养猪业带来巨大的经济损失。为在分子水平上研究PRRSV与宿主的相互作用及其致病机制，本试验构建含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的PRRSV感染性克隆，并分析了重组PRRSV的某些特性。【方法】依据北美II型PRRSV病毒株（GenBank：AY545985.1）的序列，以其感染性克隆重组质粒（pFL12）和

5、含有gfp基因的质粒（pcDNA-EF1-GFP）为模板，采用重叠PCR的方法，扩增出上、下游含有PRRSV非结构蛋白2（Nsp2）基因片段的gfp基因，并通过SpeI和XhoI位点将其插入到pFL12的PRRSVNsp2基因中，并与其融合，构建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重组质粒pFL12-GFP。重组质粒经限制性内切酶AclI酶切线性化后，经蛋白酶K/SDS处理,酚/酚氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的线性的pFL12-GFP。利用mMESSAGEmMACHINE体外转录试剂盒，在T7RNA聚

6、合酶的催化下，合成含有5´帽子结构的GFP-PRRSVmRNA。然后利用酵母Poly（A）聚合酶对5´端帽子结构的GFP-PRRSVmRNA进行加尾,使其变为成熟的GFP-PRRSVmRNA,即5´端带有帽子结构和3´端带有Poly（A）尾的GFP-PRRSVmRNA。用TransmessengerTransfection试剂将GFP-PRRSVmRNA转染仓鼠肾（BHK-21）细胞进行病毒的包装，然后用其细胞裂解液上清感染Marc-145细胞扩增重组病毒，感染48h后，用荧光显微镜观察GFP荧光及P

7、CR方法扩增含gfp基因的Nsp2基因片段确定确实拯救出了含gfp基因的重组PRRSVGFP-PRRSV。然后用亲本PRRSV和拯救出的GFP-PRRSV感染Marc-145细胞和猪的肺泡巨噬（PAMs）细胞，并对其感染性和复制能力进行初步分析。【结果】采用重叠PCR的方法将gfp基因成功地插入到了Nsp2基因的特定位点上，并与其融合，构建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重组质粒FL12-GFP。然后将PRRSV感染性克隆重组质粒进行体外转录生成GFP-PRRSVmRNA，先后转染BHK-21和感

8、染Marc-145细胞，成功地拯救出表达GFP的重组GFP-PRRSV。经分析表明，制备的重组GFP-PRRSV与亲本PRRSV一样均能感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞（PAMs），在Marc-145细胞中的增殖速度高于在PAMs细胞中；GFP-PRRSV在两种细胞中的增殖速度与亲本PRRSV相比都有所下降，但未达到显著水平。【结论】利用重叠PCR策略将gfp基因插入PRRSV感染性克隆的Nsp2基因中并与其融合，成功构建出表达GFP的PRRSV