nak泵α1亚基的h1-h2结构域介导哇巴因心肌毒性

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1、河北医科大学博士学位论文Na/K泵α1亚基的H1--H2结构域介导哇巴因心肌毒性姓名：熊晨申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：王永利201204中文摘要Na／K泵仅l亚基的H1．H2结构域介导畦巴因心肌毒性摘要强心苷(Cardiotonicsteroid，Cs)用于治疗慢性充血性心力衰竭(Congestiveheartfailure，CHF)已有200多年历史，但其加强心肌收缩力的作用机制却一直是人们争论的焦点。一般认为：Cs治疗心衰是因为其抑制衰竭心肌细胞膜上的№l+-K*-ATP酶(M队)，使细胞内Na+增加，通过Na+／Ca2+交

2、换(NCX)，引起细胞内Ca2+的升高，并促进肌浆网对钙的摄取及随后的钙释放(CICR)。增加的内钙一方面可以增加心肌收缩力即其治疗作用，另一方面当钙的增加超过了肌浆网的负荷时则表现为其毒性作用，因此，探讨强心苷如何在发挥其正性肌力作用的同时最大限度地减少其毒性是目前急需解决的问题。NKA，即N根泵或钠泵，属于P型ATP酶家族蛋白，是镶嵌在哺乳动物细胞膜上的一种蛋白质。它每水解一个ArP分子可将3个Na+转运出细胞并移入2个K+，从而维持细胞的离子跨膜梯度和电位差。到目前为止，发现粼泵是由a、B、丫亚基组成的寡聚体。0【亚单位是催化亚单位，

3、主要执行泵的功能。p亚基有Bl、B2、p，亚基，其蛋白仅跨膜一次，氨基端在细胞内，主要调节仅亚基的蛋白构型和活性；Y亚基是FXYD基因编码的跨膜蛋白，与a亚基和p亚基结合，组织特异性地调节N倦泵的转运功能。N般泵亚基的多样性决定了不同亚基构成的ATP异构酶广泛分布于不同组织，并发挥重要的生理功能。多种配体，如内源性涨泵抑制因子哇巴因、ATP、Na●和K+等，在膜外区均有结合位点。仅亚单位分为a1、U2、哟和蛳四种亚基，其中al亚基被认为是“管家"亚基。N抓泵的表达具有组织特异性和种属差异性：成年大鼠心肌主要表达0【l和毗亚基，0【3亚基表达

4、消失；而豚鼠心肌则只表达0‘l、U2亚基。催化性a亚基存在lO个跨膜结构域(H1．Hlo)，其中Hl-H2、H3一H4、H5．H6、H7．H8、H9．Hlo间的序列位于细胞膜外，称为膜外区(Fig1)，负责Na／K泵的离子转运功能。且迄今为止已发现的四种a亚基(a1-a4)中，除仅，亚基广泛分布在各组织外，其它亚型均呈现组织特异性分布特点。0【2中文摘要亚基主要分布于心脏，脑，骨骼肌，血管平滑肌细胞，眼，脂肪细胞，以及其他一些组织中。啦亚基是卵巢细胞和神经元所特有，但也存在于白细胞中和一些种属如人等的心脏细胞。啦亚基特异性存在于精子细胞上。

5、仅亚基的组织特异性分布提示其亚型在所表达的组织中具有特定功能。近年来，随着分子生物学技术与传统电生理技术的结合与应用，对心肌的Na／K泵结构一功能关系有了更加深入的认识。关于哇巴因结合位点的研究最早是通过化学标记进行的，这些研究表明哇巴因结合在Na／K泵的a亚基而不是13亚基。点突变研究和氨基酸替代实验证明，当将大鼠Na／K泵Hl-H2膜外区氨基酸Ginll1和Asnl22双突变为Asplll和Ar9122时，此Na／K泵对哇巴因的亲和力与野生型Na／K泵相比下降了千倍。由此我们推测，Na／K泵抑制因子对Na／K泵的抑制作用正是通过与Na／

6、K泵0【亚单位Hl-H2膜外区氨基酸的结合实现。提示Na／K泵Hl-H2膜外区是哇巴因的主要结合位点。除了Na／K泵Hl-He膜外区参与哇巴因结合外，其它结构区比如H3．H4及H5．H6膜外区，当嵌合在氢钾ATP酶时也表现出与哇巴因的亲和力。Fig．1Thestructt珥eforN】paisoform(Na／K泵仅亚单位结构)根据对强心苷类的亲和力不同，a亚基可分为高亲和力亚型和低亲和力亚型。其中，a1亚基对强心苷的亲和力明显低于(12和哟亚基。例如大鼠心肌细胞睨亚基仅占11％，给予3×10～mol·L．1OUA能够抑制94％的Na／K泵

7、G2亚基和1％的al亚基，但却使收缩增加约400,4，说明a2亚基在调节心肌收缩方面发挥重要作用。苏素文等在正常或心衰离体豚鼠心脏观察到，低浓度毒毛旋花子苷原(Str)均可在增强心脏收缩功能的同时兴奋或不影响Na／K泵活性，而高浓度则通过抑制Na／K泵引起心肌的不规律的收缩。昕(10pmol·L．1)在[Ca27i升高达峰值时，可使细胞挛缩，而Str(10nm01．Ld)对细胞形态无影响。Gao等提出1—10nmol·L-1强心苷能中文摘要够兴奋Na／K泵，并指出这种兴奋作用与啦亚基有关，我们实验室也证实10。10-lO—t001．LoDH

8、O(双氢哇巴因，一种强心苷)能够产生外向兴奋性Na／K泵电流，而己有实验证明强心苷有效控制心衰的血清游离药物浓度约为1．10nm01．L～，：在豚鼠离体心脏中也证实10母tool