microrna-21对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡的调控作用

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1、郑州大学博士学位论文MicroRNA--21对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡的调控作用姓名：陈晓华申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：秦兆冰201203中文摘要MicroRNA．21对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡的调控作用博士研究生：陈晓华导师：秦兆冰教授郑州大学第一附属医院河南郑州450052摘要中耳胆脂瘤是一种常见多发病，以中耳腔内高度增殖的角化鳞状上皮的积存，临近骨质的破坏为主要特征。胆脂瘤虽是一种良性病变，却具有恶性肿瘤样生物学行为，如侵袭性、迁移性、破坏性、复发性、高度增殖和分化变异性。中耳胆脂瘤所引起的骨质破坏可导致

2、听力下降，内耳功能紊乱，面神经麻痹，甚至颅内并发症。临床观察发现，儿童胆脂瘤较成人更具侵袭性和危险性。多数学者认为，儿童胆脂瘤生长速度快，易于扩散，病变范围广泛，并且术后复发率明显高于成人。目前的治疗方法主要是手术切除，但由于术后易于复发或残留，常需多次手术，故并发症的发生和听功能的障碍尤为严重。胆脂瘤发生的确切机制目前尚不明确。近年来，国内外学者从组织酶学、癌基因、细胞因子、生长因子及其受体等方面对胆脂瘤发生的分子机制进行了研究。结果发现，中耳胆脂瘤组织中许多生长因子和信号分子基因表达上调，同时与细胞增殖、分化、凋亡及骨质破坏

3、相关的蛋白质表达也明显增强。尽管有关胆脂瘤细胞凋亡能力的研究结果仍存在分歧，但大量研究证实，与正常皮肤相比胆脂瘤上皮具有类似肿瘤细胞一样高度增殖的能力。新近的研究发现，细胞的基本生物过程包括增殖、分化和死亡均受一类长20．30nt的小RNA分子，Micro(mi)RNA，通过作用于靶mRNA3端非翻译区罩的结合位点沉默靶基因表达来调控。miRNA是蛋白质翻译过程中重要的调节子，中文摘要与肿瘤和异常增生性疾病的发生密切相关。据计算分析，大约miRNA的数量占到蛋白编码基因的1％，而高达30％的蛋白编码基因可能受到miRNA的调控。

4、miRNA．21是人类细胞或组织中存在较为广泛的一个miRNA，主要通过其靶基因磷酸酶张力蛋白同源物(Thephosphatasetensionhomologue，PTEN)和程序性细胞凋亡因子-4(Programmedcelldeathfactor-4，PDCD4)在调控肿瘤异常增殖的过程中发挥着重要作用，因此又被称为“癌基因”。在炎症等的病理条件下，如LPS诱导的鼠的肺部炎症、过敏性呼吸道炎症、骨关节炎、银屑病、大肠炎、心室肥大，microRNA．21的表达增加。Sheedy等推测microRNA．21是炎症与癌症的连接桥梁

5、。有关miRNA对胆脂瘤上皮细胞增殖、分化和死亡调控作用的研究报道甚少。2009年Friedland等通过实时荧光定量PCR技术首次研究了胆脂瘤组织中一系列与肿瘤发生相关的miRNA的表达情况，发现miRNA．21调控胆脂瘤上皮的生长和增殖。2011年作者研究发现凋亡相关miRNA(apoptosis．associatedmiRNA)let．7a参与了胆脂瘤细胞凋亡调控作用，并且其调控模式不同于肿瘤细胞，而更类似于let．7a对损伤或炎症的调控。然而迄今为止，在细胞体外模型对胆脂瘤的发生和调控机制进行深入研究和干预实验尚未见报道

6、。本研究目的1．观察miRNA．21及其靶基因PTEN和PDCD4蛋白在儿章和成人中耳胆脂瘤组织中的表达情况，研究miRNA．21对儿童和成人中耳胆脂瘤上皮增殖和凋亡的作用。2．建立中耳胆脂瘤细胞体外研究模型，研究miRNA．21和其下游靶基因PTEN、PDCD4蛋白在胆脂瘤角质细胞中的表达情况。3．以介导miRNA．21抑制体的慢病毒载体感染培养的胆脂瘤角质细胞，观察下调miRNA一21对胆脂瘤角质细胞中miRNA一21及其靶基因PTEN和PDCD4蛋白表达的影响，以及细胞增殖、凋亡能力和侵袭性的改变，为开展基于miRNA的基

7、因治疗或联合治疗提供实验依据。中文摘要第一部分MiRNA．21在儿童和成人中耳胆脂瘤组织中的表达研究方法1．提取21例成人(年龄≥18岁)中耳胆脂瘤组织及其耳后正常皮肤组织，2l例儿童(年龄S14岁)中耳胆脂瘤及其耳后正常皮肤组织中的miRNAs，利用紫外分光光度仪检测miRNAs的浓度和纯度。2．利用荧光定量PCR技术检测儿童、成人中耳胆脂瘤组织和儿童、成人耳后正常皮肤组织中miRNA．21的表达。3．提取中耳胆脂瘤组织中的总蛋白，利用westemblotting技术检测miRNA．21下游靶基因PTEN和PDCD4蛋白在各组

8、织中的表达。结果1．MiRNA．21在中耳胆脂瘤组织中的表达高于耳后正常皮肤组织中的表达，在儿童中耳胆脂瘤组织中的表达高于成人中耳胆脂瘤组织(尸<0．05)，而在儿童耳后正常皮肤组织和成人耳后正常皮肤组织中的表达无差异(尸>O．05)。2．PTEN和PDCD4蛋