cxcr4基因合成及其在兔骨髓间充质干细胞中表达的初步研究

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1、东南大学硕士学位论文CXCR4基因合成及其在兔骨髓间充质干细胞中表达的初步研究姓名：谢志阳申请学位级别：硕士专业：临床医学指导教师：吴小涛2012-05-25中文摘要CXCR4基因合成及其在体外兔骨髓间充质干细胞中的表达东南大学临床医学院研究生：谢志阳导师：吴小涛教授目的：研究表明SDF一1／CXCR4信号轴在移植细胞向损伤部位迁移中发挥重要作用，而于细胞能够对退变椎州盘起修复作用。本实验室前期实验中已经发现在人和兔退变的椎间盘组织中存在着SDF-l的浓度表达梯度，但由于CXCR4在MSCs表面的表达率比较低，可能影响其向损伤部位迁移

2、。所以本研究旨在合成CXCR4基因，构建CXCR4真核表达载体并转染~ISCs，提高CXCR4在MSCs的表达，进而为后期利用SDF一1／CXCR4轴的趋化机制提高MSCs的迁移效率并促进对退变椎l、BJ盘修复提供实验基础。材料和方法：1．根据GenBank中已发表的兔CXCR4(GeneID100346189)编码区全长及酶切位点需要，设计重叠引物，采用OE—PCR的方法合成CXCR4的cDNA。双酶切将pIRES2-EGFP真核表达载体，{flCXCR4基冈片段连接，构建CXCR4一pIRES2一EGFP重组质粒，转化抽提质粒并保

3、存。进行双酶切、PCR及测序鉴定。2．复苏前期实验中冻存的BMSCs，建立体外培养体系。3．脂质体法转染无内毒素重组质粒及空白质；断lJBMSCs，观察细胞生长情况，荧光显微镜观察EGFP表达情况。0一actin作为内参半定量RT—PCR检i贝1]CXCR4瞬时转染效率。4．在Transwell小室内观察MSCs、空白质粒转染MSCs、CXCR4一MSCs对SDF—l的体外趋化迁移情况。5．预实验获取G418筛选浓度，(；418筛选MSCs。结果：1．酶切、测序答定均证明CXCR4cDNA年FI。艰纰质卡itCXCR4一pIRES2一

4、F(；FP构建币确，大最提取的无内毒素质粒¨J．以用作进‘步实验。2．复苏后的MSCs_-K形念、活／川lI线及增嫡情况均提示细胞复苏成功。：；．转染K,244、时荧光妊微镜一卜-I—J‘见绿色’荧光蛋白表达提示转染成功，二}三定量RT—PCR提示CXCR4表达量较窄白组l增性约21％。4．SDF-l浓度为()H寸，三组细胞迁移数日无明最筹异(p>O．05)：SOlIl浓度为10，100ug／l时，CXCR4转染组细胞迁移数F1明显高j『．未转染组怫l空白质粒转染组(p

5、活细胞的绿色荧光蛋门表达率’』术筛选前尢【¨j显謦异(p>O．05)。结论：1．震川(。小一㈦k成功介成兔(’Ⅵ刚c‘

6、)＼A：2．成功f；』缱J7携崩，“饱【’．＼(、}“j占i人⋯，J(‘X(’Rl川Rlis2Ii(；I?l’ri}幺灰j三找1书，jl：东南人学帧Ij学位论文扩大提取保存，可以直接用于转染兔骨髓间充质二}二细胞，亦可作为慢病毒转染的穿梭质粒；：；．成功复苏了液氮冻存的兔骨髓f’fJJ充质}二细胞，并建立了稳定的高纯度细胞系；4．使川构建的CXCR,1一p【REs2一隔"真核挺达载体成助4：擘染兔骨髓问充质一f-细胞

7、；5．CXCR4一PIRI']S一哺FP质拳证转染法雄以获搿II，稳定农达CXCR“内兔骨髓问充质干细胞株。[关键词]CXC趋化因子受体4；全基因合成；克降表达；洲充质一F．细胞；英义摘受SYNTHESlSlNG0FCXOR4ANDlTSEXPRESS10NRABBlTBONE—MARROWMESENCHYMALSTEMCELLSlNVITROPostgraduate：XieZhiyangSurrv‘sor：Pro：WuX。ao-taoUpervisorroiaao：MedicalCoIegeofSoutheastUniverSity

8、EngI．shAbstractObjective：RecentresearchesshowthatSDF一1／CXCR4signalingaxismediatesdirectedmigrationofstemcells．AndintheresreachbyourLab，SDF-1isexpressedinbothhumanandrabbitintervertebraIdiscs．TheexpressionsofSDF一1indegeneratedhumanintervertebraldiscscanformateaSDF一1conce

9、ntrationgradientwhichmayplayasignificantroleinmediatingmesenchymalcellsmigratetothedegeneratedinter、，ertebraId