新生儿窒息后血清诱导hk-2细胞凋亡的胞内信号传导机制分析

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1、泸州医学院研究生硕士论文蛋白形成调控细胞凋亡的中心环节。那么，在窒息后血清诱导肾小管上皮细胞凋亡中是否有线粒体途径的激活呢?核因子．KB(NF．r．B)作为调节细胞基因转录的关键因子之一，是炎症反应的触发器及关键环节。已证实NF．rd3是调节编码多种前炎症介质、细胞因子和粘附分子基因的重要转录因子。目前研究证实窒息后血清诱导HK-2细胞凋亡的机制牵涉到NF．KB的活化。活化后的核因子叫(B是否参与线粒体途径的激活呢?因此，本研究在前期实验的基础上，探讨新生儿窒息后血清对HK．2细胞内线粒体膜电位变化，相关凋亡蛋白释放

2、以及促凋亡蛋白表达的影响及其与NF．1(B活化的关系，旨在阐明窒息后肾小管损伤的机制。目的：研究新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(胍．2)凋亡的胞内信号传导机制。方法：(1)以人近曲肾小管上皮细胞(HK一2)为研究对象，用含10％胎牛血清的DMEM／F12完全培养基进行传代培养。(2)新生儿窒息后血清的制备：选择2006年9月"-'2007年6月在我科住院的未使用免疫抑制剂、无明显感染性疾病的足月重度室息新生儿。在窒息后24h抽取外周血5mL(肝素抗凝)，离心并分离出血清，灭活补体后一20℃保存备用。(3)窒

3、息后血清诱导腿一2细胞损伤模型的建立：采用上述方法处理的窒息后血清，用DMEM／F12培养液配成20％(体积比，v／v)的攻击浓度，攻击正常培养的胍一2细胞。(4)实验分组：共分为三组，即正常对照组、窒息组和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组。PDTC是NF—KB的特异性抑制剂，根据前期实验结果，我们应用的终浓度为40laM。即在实验前24h将培养液换成含20％窒息血清的DMEM培养液的同时加入409MPDTC。(5)第4页其75页泸州医学院研究生硕士论文检测指标：倒置相差显微镜下观察HK一2细胞生长情况；激光共聚

4、焦显微镜测胍一2细胞线粒体膜电位(MMP)变化；免疫细胞化学方法检测HK一2细胞胞浆内促凋亡蛋白Bad、Bax的表达情况；Westernblot测HK．2细胞内线粒体中CytC，AIF的释放情况。(6)统计学分析：采用one．wayANOVA分析，组间比较用LSD法。数据均用z±S表示，采用SPSSl0．0软件处理。P

5、少，形态变为不规则圆形或椭圆形，折光性减弱，胞质中出现空泡，脂滴，颗粒样物，细胞间连接松散，并可见较多细胞碎片。PDTC干预组较对照组细胞数量变化不大，形态变化小，部分细胞有收缩变圆，细胞折光性较强。(2)与正常对照组(2．96+0．38)相比，窒息组(O．87+0．06)和PDTC干预组(2．46+0．52)细胞线粒体膜红／绿荧光强度比值(590／530nm)t)j显降低，差异具有显著性意义(P

6、)用HSCORE系数作半定量评分，与正常对照组【(1．97+0．26)和(1．77+0．11)】相比，窒息组[(2．73+0．20)和(2．444-0．13)】和PDTC干预组[(2．38+0．13)矛1(2．17士0．08)】促凋亡蛋白Bad、Bax的表达均明显增加，差异具有显著性意义(P<0．01)；但与窒息组相比，PDTC干预组促凋亡蛋白Bad、Bax的表达显著减少，差异有统计学意义(P

7、79．5士2．12)；窒息组胞浆中细胞色素C从线粒体漏出较对照组明显增加，相应的在线粒第5页其75页泸州医学院研究生硕士论文体内表达减少，条带光密度值分别为(177．5士3．54，155-4-4．24)，差异有统计学意义(P

8、IF从线粒体中漏出，在线粒体内基本检测不到AIF表达，条带光密度值为(1284-4．24)；PDTC干预组较窒息组线粒体内AIF表达明显增加，条带光密度值为(201-4-8．49)，组间比较差异有统计学意义(P