转录因子foxo3a在口腔鳞癌中的作用及在肿瘤靶向治疗中应用的初步研究

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1、浙江大学博士学位论文转录因子FOXO3a在口腔鳞癌中的作用及在肿瘤靶向治疗中应用的初步研究姓名：方亮申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：王慧明201203浙江大学博士学位论文中文摘要转录因子Fox03a在口腔鳞癌中的作用及在肿瘤靶向治疗中应用的初步研究浙江大学医学部博士研究生导师口腔颌面外科学方亮王慧明教授中文摘要目的：口腔鳞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一．口腔鳞癌的治疗，目前主要以外科手术为主，协同放化疗或生物治疗等的综合治疗，虽已取得了一定效果，但对于中晚期口腔鳞癌患者，疗效仍不理想，总体生存率并无显著提高．本文将研

2、究转录因子FOx03a在口腔鳞癌中的表达及其功能活性调控与P13K，AKT信号转导通路的相互关系，同时探讨FOX03a功能再活化对口腔鳞癌细胞在体内外的抗癌作用．通过本研究，拟为靶向治疗筛选口腔鳞癌癌变过程中的关键基因，为今后口腔鳞癌靶向治疗研究打下一定的基础，以期为口腔鳞癌提供一种新的治疗策略以补充甚至替代现有的治疗手段．方法：’l、应用Real栅PCR与免疫组织化学的方法分别在mRNA与蛋白水平检测63例口腔鳞癌组织标本和癌旁正常组织中转录因子FOX03a基因的表达，并通过统计处理，分析其基因表达与烟酒暴露、肿瘤部位、大小、删临床分期、病

3、理分级及淋巴结转移等临床病理的相关性；初步分析FOx03a基因表达与P13K，AKT信号转导通路中的癌激酶舢I汀的活性蛋白p—港了表达的相关性．2、单纯或联合应用IGF．1与P13K，AKT信号转导通路抑制剂LY294002处理口腔鳞癌细胞，通过蛋白免疫印遗法检测AKT的活性蛋白pAKT表达水平，反n浙江大学博士学位论文中文摘要映P13粼T信号转导通路的激活或抑制状态；应用蛋白免疫印迹法检测FOX03a及p-FOX03a蛋白在细胞总蛋白及胞浆胞核蛋白中的表达变化；应用lkal．tiIIlePCR与蛋白免疫印迹法分别在mRNA与蛋白水平检测在致

4、癌过程中与FOX03a功能活性状态相关的p27、Bim、CDK4、CDl“及cycliIlDl等基因的表达变化；经转染FOx03a转录特异性DNA结合序列的荧光素酶报告基因质粒及野生型FOX03a表达质粒后，应用双荧光素酶报告基因法检测FOX03a与其转录启动予特异性DNA序列的结合能力，从而探讨P13K／AKT信号转导通路与FoX03a功能活性的调控作用．3，应用小RNA干扰技术和基因克隆DNA熏组技术(野生型FOX03a／FOX03a-WT与构造活化型FOx03a印AKT依赖的磷酸化位点突变型／FOX03a-3A)研究FOX03a基因表达

5、沉默或过表达对口腔鳞癌细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期分布等体外生物学行为及接种裸鼠皮下对体内移植瘤成瘤能力的影响．应用胁1．t硫PCR与蛋白免疫印迹法分别在mRNA与蛋白水平检测在致癌过程中与FOx03a功能活性状态相关的p27．BiIn、CDl“、CDK6及cycliIlDl等基因表达，及FOxO家族中FOXOl与FOX04的表达情况，分析上述基因表达与FOX03a功能活性的相关性，探讨FOX03a对口腔鳞癌细胞在体内外抑癌作用发挥的可能效应靶基因．‘4、探讨Cispla血与R印锄ycill分别单纯或联合处理口腔鳞癌细胞后FOX03a基因的表

6、达、蛋白在细胞内定位及转录活性情况等，并检测其对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期分布等体外生物学行为的影响，同时对FOx03a可能的效应靶基因p27，Bim、CDK4、CDK6及cyclinDl的表达进行检测．应用小l矾A干扰沉默FOx03a表达，体外筛选并培养稳定沉默FOX03a表达的口腔鳞癌细胞，与其父代口腔鳞癌细胞分别接种裸鼠皮下，采用CiSpl撕n与Rap锄ycin分别单独或联合治疗移植瘤，在体内观察药物对肿瘤细胞生长的作用，并探讨FOX03a功能再活化在其中所起的作用．结果：l、与全身其它恶性肿瘤类似，口腔鳞癌临床组织标本中同样发现FO

7、X03a蛋nl浙江大学博士学位论文中文摘要白表达水平的降低，但其In】刚A表达水平无明显变化．FOX03a蛋白表达的降低与患者的吸烟、饮酒、肿瘤大小．删临床分期，淋巴结转移等临床病理指标问未见明显相关性，但FOX03a蛋白表达的降低与肿瘤的病理分级及癌激酶剐I(T的活性蛋白p．JU汀表达水平具有显著相关性．2、通过IGF．1处理口腔鳞癌细胞后，我们发现癌激酶剐I玎的活性蛋白pAKT表达明显上调，当采用P13K，AKT信号转导通路抑制剂U陀94002处理后，pAKT蛋白表达则显著降低，即证实通过上述两种处理能够调控P13K，AKT信号转导通路的

8、活性．通过抑制或激活P13K／AKT信号转导通路的活性，我们发现FOX03a转录功能失活与癌激酶AKT的功能异常活化相关，AKT具有对胞核内FOx03a蛋白磷酸化修