用mes稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究

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山东农业大学硕士学位论文用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究姓名：高维强申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：谭景和；常仲乐20120614 山东农业大学硕士学位论文’●‘●-●●．‘．中文摘要．．．‘．精液的冷冻保存是精液长期保存的有效方法，该技术在牛的精液保存已得到突破并实现商业化，牛冷冻精液的体外受精或人工输精可以获得理想受精率。但是山羊的精液冷冻效果却不理想，尽管解冻后活力可达30％以上，但受精率和妊娠率较低。因此延长山羊精液液态保存时间和提高山羊精液液态保存质量成为促进山羊人工授精技术推广应用的关键技术。我们在刘长河MES箩O黄包被液态保存山羊精液16天活力维持在30％以上的基础上，通过对母羊同期发情处理，分别用保存12、13、14、15、16天的精液人工输精，并对返情和妊娠情况进行记录。保存过程中精子存活时间和受精能力会受到许多因素的影响，例如离子成分、氧化应激、代谢性酸中毒、DNA断裂、精子质膜脂类和蛋白组分发生变化、顶体反应以及自发获能等，发现并消除这些不利因素，减少精液保存过程中精子受到的损伤，构建成分简单明确而又适宜精子体外存活的保存系统，将为精子代谢机理研究提供广阔空间。我们以山羊为试验动物，以MES、Nacl等构建了成分简单的pH6．25的MES稀释液，并在此基础上对液态保存过程中精子果糖代谢机理进行了研究，以丰富“精子代谢机理”基础理论，为动物生产和医学临床提供理论依据。实验表明：(1)保存15、16天的精液用于输精不能达到预期效果，基本都返情：(2)保存12、13、14天的精液进行输精，这时的活力能在50％，这部分结果还没拿到。(3)在15℃条件下，精子既能维持4天的活力，又能保持一定强度的代谢活动，适宜我们研究代谢。(4)15℃保存时，稀释液中添加lOmM果糖效果最好，精子活力保持30％以上的保存时间能达到6d。而葡萄糖浓度超过10mM／L时，保存效果反而下降，精子活力保持30％以上的保存时间又逐渐缩短。(5)．15℃保存时，在含有果糖的稀释液中添加碘醋酸酯(Iodoacetate)阻断精子糖酵解途径，能显著降低精子活力，缩短精液保存时间(6)15"C保存时，在含有果糖的稀释液中添加脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)●阻断精子磷酸戊糖途径，对精液保存时间和山羊精子活力有一定的影响。这还有待我们进一步进行研究确认。总之，通过本研究我们主要获得以下结论：1)保存15、16天的精液用于输精不能达到 用MEs稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究预期效果，基本都返情；2)15"C保存时添加果糖有利于山羊精子活力维持；3)15"C保存时，成分简单的MES中添加10mM／L的果糖保存效果最好，最有利于山羊精子存活，超过lOmM／I。开始对精子产生不利影响：4)山羊精液液态保存过程中，山羊精子活力维持和对果糖的代谢利用依赖于糖酵解途径；5)山羊精液液态保存过程中，山羊精子活力维持和对果糖的代谢利用可能在一定程度上依赖于磷酸戊糖支路，但还有待进一步研究确定。关键词：山羊精液；液态保存；同期发情；人工输精；果糖代谢；代谢途径2 山东农业人学硕二￡学位论文Fructosemetabolismandartificialinseminationofgoatsemenliquid-storedintheMESextenderabstractThebestwayforsemenstorageiscryopreservation，whichhasbeenusedforbullsemenstorageandartificialinseminationsuccessfully．Cryo-preservationofbullSemenhasbeencommercializedformanyyears．Howev日，thecryopreservationforgoatsemenisnotsuccessful．Althoughthemotilityofpost-thawSemenisupto30％，thefertilityrateandpregnancyratearemuchlowerthanthatoffreshsemen．Itisnecessarytofmdalong-timeliquidstorageprotocolandimprovethequalityofliquidstorageatpresent，anditiscriticaltechnologyinexpandtheuseofartificialinsemination．OnThebasisofthemotilityofsemencoatedwithMESinpH6．25isupt0in16thday，weemploythesemenstoredfor12、13、14、l5、16daysforartificialinsemination,andrecordthereturnrateandconceptionrateforassessmentofstorageefficiency．MotilityandfertilityofstoredsemenisinfluencedbySOmuchfactorsaselectrolyte，oxidativestress，membolicacidosis，DNAfragmentation,Sheddingoffspecificlipidconstituentsfromspermcellmembraneduringpreservation,spontaneouscapacitationetc．Itisnecessarytofindandeliminatetheseunfavourablefactorsandtoconstructachemicaldefinedextendersandallefficientsemenstorageprotocoltoexpandliquidstoragesemeninvitrofertilizationandartificialinsemination．Therefore，theapplicationofchemicallydefinedextenderswillhaveobviousadvantagesinlongtermliqmdstorageofbucksemen．Atthesametimethissystemwillprovideaplatformforinvestigatingmetabolismmechanismofgoatspermduringlongtermliquidstorage．TheaimofthepresentstudyWastoconslructachemicaldefinedandsimpleextenderstoinvestigatefructose．metabolismduringliquidStorage．Theresults棚℃summarizedasfollows：1SemenCaninaintainmotilityfor4daysin15"C，andthemetabblismfrequencyismoderate．‘2Itisfavourableforliquidstoragein15"(2tosupplementfructosetoBM，thebestresultiSobtainedwith10mM／Lfructose．WhentheconcentrationoverlOmM／IqitiSunfavourableforliquidstorage．3- 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究3MotilityofgoatspermextendedwithBMcontainingfructosesupplied、Ⅳithiodoacetate，inhibitorofglycolysis，werelowersignificantlythanthecontrolwhichdidn’tcontainiodoacetate．Meanwhilethetimeofspermmotilityofexceeding30％maintainedfordeclinedsignificantly．4MotilityofgoatspermextendedinBMcontainingfructosesupplied、Ⅳit}ldehydroepiandrosterone(DHEA)，inhibitorofpentosephosphatepathway，werenotsignificantlylowerthanthecontrolwhichdidn’tcontaindehydroepiandrosterone．ButtheresultstilltObecertificated．5Liquidstoragesemenin15m、l矿forartificialinseminationcannotmakeewesconception，ewesreturntOestrus．．6Themotilityofliquidstoragesemenin12m、13m、14血isuptO50％，whenusedforartificialinseminationmaybeCallgetbetterresult．Theresulthavenotbeenobtained．Theresultsshowthat：1)liquidstoragesemenin15m、16mforartificialinseminationCallnotmakeewesconception，eWeSreturntoestrus；2)Itisfavourableforliquidstoragein15℃tosupplementfructosetosemenextender；3)thebestresultisobtainedwith10mM／Lfructose，itisunfavourableforliquidstorageoVerIOmM／L；4)Spermmetabolizesfi-uetosebyglycolysispathway，becauseofinhibitingglycolysispathwayinfluencesperm’Ssurvivalduringlongtermliquidstorageat15"C；7)Spermmaybemetabolizesfructosebypentosephosphatepathway,theresultstilltobecertificated．‘Keywords：bucksemen；liquidstorage；synchronizationofestrus；artificialinsemination；fructosemetabolism；metabolicpathway4 符号说明HEPES：N-【2一Hydroxyethl]piperazine—N’【2-ethanesulfonicacid】，N-2-羟乙基哌嗪PVA：polyvinylalcohol，聚乙烯醇EDTA：Ethylenediamine．tetra-aceticacid，乙二胺四乙酸ROS：reactiveoxygenspecies，活性氧LPO：lipidperoxidation，脂质过氧化MES：分子式Cc,I-Ij3N04S，2．(N．吗啉代)乙磺酸MES稀释液：mZAP改进缓冲系统后的稀释液mZAP-山羊精液稀释液LDL．Low-DensityLipoprotein，低密度脂蛋白AAAO：aromaticaminoacidoxidase，芳香族氨基酸氧化酶PUFA：polyunsaturatedfattyacid，多不饱和脂肪酸NADPH：nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸PPP途径：pentosephosphatepathway，磷酸戊糖途径SCA：spermclassAnalyzer，精子分析仪 山东农业大学硕士学位论文●‘．‘前言精液，精子以及经过选择的精子亚群的保存技术是繁殖医学(BarratandChauham，1990)和现代集约化动物生产所需要的繁殖生物技术(Niemann，1991)研究的重要内容。为保护濒危动物和野生动物，精子、卵和胚胎的保存技术变得越来越重要(Wildt，1989)。’世界范围内，体外受精和人工授精大多数采用稀释后保存的精液进行，精液保存技术使精子不受时间、地域和种畜个体限制，便于开展区域间协作，最大限度提高优良种公畜的利用率，加速品种育成和改良。同时，对优良种畜在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体优良遗传特性，以及进行血统更新、引种、降低生产成本等方面也都有重要意义。1．1精液保存的方法和基本途径精液保存是为了延长精子存活时间，扩大精液使用范围。现行的精液保存方法主要有冷冻保存和液态保存两种，冷冻保存(--78"---196"C)可以实现长期保存，但是目前除了在牛的精液冷冻保存中获得了较好的效果以外，其他物种的精液冷冻保存效果和受胎率都不尽理想。近年来人们又将人工授精工作的重点都放在液态精液的应用上，特别是猪，马，羊，兔等家畜冷冻精液目前尚难在生产上推广的情况下，精液的液态保存仍然有很大的实用价值。液态保存时间短．(小于30天)，但需用设备简单，操作方便。液态保存根据保存温度的不同又分为常温保存(15～25℃)和低温液态保存(O～5℃)，这两种保存方法的保存温度均在0℃以上，以液态形式做短期保存，故称液态保存(Salamoneta1．，2000)。液态保存的基本理论依据是：暂时地抑制或者停止精子的运动，降低其代谢速度，减缓其能量消耗，以便达到延长精子寿命而又不使其丧失受精能力。其基本途径有三条：一：是适当降低保存温度，减弱精子运动和代谢，甚至使精子处于休眠状态，又不丧失活性。二：是适当降低稀释液的pH，使精子处于弱酸环境下，既不至危害精子，又能有效抑制精子的运动。在以上两种处理下保存的精子，一旦温度和pH值恢复到正常生理．水平，精子又可恢复它们的正常运动和代谢水平。三：是隔绝空气造成缺氧环境以减少氧自由基对精子的破坏都能强化保存效果。无论哪种保存形式，都以抑制精子代谢活动，．降低能量消耗，延长精子保存时间而不丧失受精能力为目的。．精液在体外存活的过程中其存活时间和受精能力会受到许多因素的影响，例如氧化应激、代谢性酸中毒，染色质碎裂、质膜结构中脂类和蛋白组分的变化，顶体反应等。S 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究发现并消除这些不利因素，减少精液保存过程中精子受到的损害，构建更加适宜精液体外存活的环境，必将为精液液态保存的应用提供更大的利用空间。在精液液态保存的过程中人们采用了许多方法提高精液的保存时间和精子活力，抑制精子代谢活动，降低能量消耗，保护精子的线粒体，以达到延长精液保存时间而不丧失受精能力的目的。目前用来抑制精子代谢活动的途径有：(1)使保存精液与空气隔绝或充入二氧化碳，造成精子的缺氧环境；(2)加入适宜物质造成精子的弱酸环境：(3)降低温度造成抑制精子活动的低温环境：(4)加入适量抗生素，造成精子的抑菌环境；(5)加入适量营养及保护物质，补充精子的能量消耗，造成适宜精子的生存环境。一但温度和pH值恢复到正常生理水平，精子又可恢复它们的正常运动和代谢水平。中国具有丰富的山羊品种资源，山羊饲养量居世界首位，我国并不缺乏优秀的种质资源，无论从数量上还是从质量上我们都有将其规模发展扩大的潜力。但目前在中国饲养山羊多数还是小规模分散饲养，传统的饲养方式限制了优良基因的扩大，加上中国山羊良种化程度不高，很难使中国的山羊养殖形成规模并走上健康持续发展的轨道。随着近年来良种工程的推广应用，羊的人工授精技术也得到日益重视，但由于山羊精液冷冻保存后活力和情期受胎率都较低(26．4％和46．3％)限制了其在生产中的应用，此外，山羊液态液态保存时间过短也在一定程度上制约了山羊人工授精技术的推广，因此研究影响山羊精液液态保存的因素延长精液液态保存时间，发明一种有效的液态保存稀释液对进一步推广山羊的人工授精技术变得尤为重要。1．2国内外山羊精液液态保存研究进展国外：山羊精液保存的稀释液有很多：柠檬酸钠一卵黄；柠檬酸钠一果糖二卵黄；蔗糖．EDT：CaNa2．卵黄；Spermasol；Dilopten；Neoseminan；IVT等(Leboeufeta1．'2000)。以上的稀释液中除TNeoseminan)F其他的低温保存5—72h的活率和受精能力有很大变化。在4℃用Neoseminan稀释液保存山羊精液8一15天期间，前6天有受精能力(NishikawaCta1．，1961)。但由于Neoseminan的成分复杂，含有能使卵黄沉淀的丙酮，使精子不能维持受精能力而没有应用价值(CorteelOta1．，1967)。其它的稀释液由于精浆与卵黄或精浆与乳汁的相互作用产生对精子有害的物质，而没有获得满意的结果。很多研究者用没有去除精‘●浆的精液，于低温保存5—8h的精子的活率和受精能力还可以，但随着保存时间的延长(12--24h)受精能力明显降低。Azawi等(1993)研究了用几种不同稀释液l：10稀释后，4℃下保存Shami山羊精液的效果，结果发现YrF(卵黄—确卜果糖)稀释液的效果最好，6 山东农业大学硕士学位论文．：：．。’’··：：．‘．·．．精子活力维持39％以上的保存时间为96h。Roca等(1997．)研究了未去除精浆的Murciano—Granadinafl-!羊精液5"C条件下用Tris．卵黄稀释液保存后的活力和受精能力。结果发现无论繁殖季节还是非繁殖季节，保存后的受精力没有显著差别，不过他们的观察时间很短，仅观察了96h，96h后，精子的活力都下降到了30％以下。Pomares(1994)报道在Tris为基础的稀释液中添加谷胱甘肽过氧化酶(1u／m1)，在5"C保存12天，能够提高精子活力。Leboeuf等(2003)报道，用含NPPC的保存液和脱脂乳液态保存山羊精液，4"C的保存效果优于15℃的保存效果，在含有NPPC的保存液中，精子的活力维持在30％以上，可以保存7天。Salvador等(2006)研究了以乳汁为基础的稀释液中添加明胶和半胱氨酸对5"C条件下保存山羊精子的影响。结果发现保存72h后，添加明胶组精子的活力可达67％。赵晓娥等(1999)在保存波尔山羊精液时所用的稀释液为：309／L葡萄糖、139／L柠檬酸钠和Ig／LEDTA并添加5％的卵黄，他们使用此稀释液液在4"C保存波尔山羊精液，保存96h后活力达52％。C．LXu(2008)使用自己研制的mZAP稀释液保存鲁北白山羊精液，5℃条件下精予活力维持30％以上的时间可达9天，用保存7天的精液进行人工输精，有31．6％的妊娠率。B．TZhao以mZAP稀释液为基础，采用换液的方式，‘将保存时间延长到了13天。．：山羊精液液态保存中，不同的pH值对精子质量的影响研究较少。在国内，牛树理等(1994)研究了PH6．5，PH7．0的稀释液对山羊精液保存的影响，结果表明PH6．5的稀释液精子的存活时数，生存指数都高于PH7．0的同一种稀释液。C_LXu(2008)以mZAP稀释液为基础，研究了pH5．54，pH6．04，pH6．64，pH7．14不同稀释液对山羊精液保存的影响，结果表明pH6．04的稀释液保存效果好于其他pH值，保存9天后活力可达30％。Stuart等(2000)研究不同pH值对人新鲜精子活力的影响时发现，从pH7．5到pH4．0的范围内，精子钝化和死亡的速率与氢离子的浓度成高度的线性相关。人精子在pH6．0和pH5．5的环境中lO分钟其活力就会显著下降，随后把精子再放入pH7．2的环境中，其活力有所恢复，但不能恢复到初始水平，说明pH6．0和pH5．5的酸性环境已经开始对精子的活力产生损害，而且这种损害是不可完全恢复的。’·‘．。_J1．3精子中糖类代谢1．3．1不同糖类物质在精子中的作用糖类物质分为单糖、双糖、多糖等。单糖中的果糖、葡萄糖能穿过精子质膜进入精7‘ 用ME5稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究子进一步分解代谢产生能量，为精子提供能量：其它糖，如蔗糖、棉子糖、海藻糖和葡聚糖，这些糖虽不能穿过精子质膜，但是能为精子提供一定渗透压，使细胞适度脱水，降低胞内冰晶形成几率，同时也能与质膜磷脂相互作用，提高精子质膜稳定性，利于精子存活(Moliniaeta1．，1994a；Aiseneta1．，2002)。非穿透性糖提高质膜稳定性可能的机理：这些糖渗透进入精子质膜，与膜磷脂的极性端结合形成稳定的氢键，从而起到稳定质膜作用(Liueta1．，1998；AboaglaandTerada，2003)；而海藻糖能使质膜中蛋白质和磷脂发生重组，增加质膜流动性，抑制“由于温度变化引发的质膜脂质相变带来的损伤反应”的发生，同时还抑制细胞过度脱水(AboaglaandTerada，2003)。这些二糖与单糖不同，是主要的低温冷冻保护剂，主要用于精子冷冻保护研究(Moliniaeta1．，1994a：Aiseneta1．，2002)，有关这些二糖在液态保存中的应用的文献不多，如SalamonandMaxwell(2000)认为“在液态保存中，二糖(如蔗糖)可能只是起到在胞外维持稀释液渗透压、维持质膜完整性的作用”。1．3．2精子可代谢利用的能量物质．哺乳动物精子能代谢利用的物质主要是单糖和一些三碳糖类物质：单糖，包括葡萄糖、果糖、甘露糖等(Mann，1975：JonesandConnor，2000：Rigaueta1．，2002：Marineta1．，2003；Medranoeta1．，2006a)；三碳糖类包括丙酮酸(BavisterandYanagimachi，1977；Burkmaneta1．，1984：Bruemmerteta1．，2002)、乳酸(BavisterandYanagimachi，1977：RogersandYanagimachi，1975)、乙酸(Scotteta1．，1962)等能量物质。但是不同物种精子能代谢利用的能量物质是不同的，甚至对同一物质的代谢能力也是有差异的，这意味着：。1)同一物种代谢利用不同能量物质的效率不同。比如，与果糖相比，人(Nagaieta1．，1982)、水牛(AtrejaandGanguli，1978)、牛(RikmenspoelandCaputo，1966)和猪(JonesandConner，2000)、狗(Suppawiwateta1．,2004)的精子优先代谢利用葡萄糖：。’2)不同物种代谢利用同一能量物质的能力也不同。比如绵羊、牛精子代谢利用乙酸的能力比狗精子强(Scotteta1．，1962)。保存过程中稀释液中添加各种糖(单糖、双糖、三糖)对精子的影响主要见于冷冻保存后的精子，其中乳糖(二糖)、蔗糖(--糖)、棉子糖(三糖)、海藻糖(--糖)和葡聚糖不能扩散通过精子质膜进入精子内部，它们只是维持一定渗透压，使细胞适度8 山东农业大学硕士学位论文．．．!．．·．．．‘‘。j脱水，降低细胞内冰晶形成率；而且这些糖与质膜上的磷脂相互作用，稳定质膜，增加冷冻后精子存活率(Aiseneta1．，2002)，其中海藻糖增加质膜流动性，对精子质膜的保护作用效果最好，增强精子抗冷打击能力(AboaglaandTerada，2003)。许多种类的单糖已被应用在绵羊精液保存过程中，以维持精子活力。早期研究一般是在卵黄．柠檬酸或卵黄．磷酸盐稀释液中添加果糖或葡萄糖进行研究(Quinlaneta1．，1941；Sakala，1957；SalamonandRobinson，1962)。而5℃保存时，在成分简单的电解质溶液中添加果糖、葡萄糖、乳糖或蔗糖能获得较高的精子存活率(Martin，1966)。然而LapwoodandMartin(1966)研究表明，512保存条件下，稀释液中添加葡萄糖和甘露糖降低绵羊精子存活率，而添加戊糖和半乳糖能维持精子活力。Suppawiwateta1(2004)研究表明Tris．卵黄稀释液中添力170mM／L果糖保存效果最好，当保存液中含有等量果糖和葡萄糖时，狗精子主要代谢利用葡萄糖。Rigauetal(2002)对比了狗精子代谢葡萄糖和果糖的能力，研究认为：孵育液中单独添加葡萄糖和果糖(均为10mmol／L)均能快速增加狗精子细胞内6．磷酸．葡萄糖、6一磷酸一果糖、ATP、糖原、乳酸的含量，而果糖比葡萄糖影响更显著，这可能是由于己糖激酶催化果糖和葡萄糖(低浓度区间：0．1～3．0mmoFL)的活性不同所致。有关“动物精子对能量物质利用的研究”大多数是在37℃进行的，并且孵育时间大多都很短暂(一般l~2h)，也没有深入研究出现这种现象的原因或者机理。1．3．3精子能量代谢特点．．精子发生的过程中，精子为了完成授精功能在变态过程丢失了绝大部分细胞质导致精子丧失其生物合成、修复、生长、分裂的功能，只保留其代谢功能(Hammerstedt，1993)。精子进行新陈代谢是维持其生命和运动的基础。精子发生过程中丢弃多余细胞质，使得精子只能利用精清或环境中的代谢基质和自身的某些物质进行分解代谢，精子分解代谢产生的能量转化为ATP，大部分用于满足精子维持其活力的能量需要，其它部分用于维持精子质膜完整的主动运输功能，以防止重要的离子成分从细胞内流失；精子在维持其生命活动过程中，除能分解利用糖外也能分解脂质而获取能量，缺乏外源性能量物质时，精子甚至可以分解自身的磷脂来获取能量：有果糖存在时，精液中的缩醛磷●脂不被分解；当精子大量消耗氧而代谢基质得不到补充时，不久将会因能量的耗竭而丧失生存力：此外，正常情况下精子无需分解利用蛋白质来获得能量，因此精子对蛋白质的分解代谢往往表示精液已开始变性，是精液腐败变性的标志之一。精子的代谢主要用9 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究来维持运动，精子代谢完全依赖于外部环境中营养物质的供给并运走代谢废物。如果我们能给精子提供足够的能量底物，同时不断将其代谢产物转运走，精子就能存活较长时间(Salisbury，1965‘)。处于不同阶段的精子对能量的需求是不同的。圆形精子细胞主要以乳酸和丙酮酸作为能量底物，很少利用葡萄糖；附睾精子主要通过糖酵解获得能量；在顶体反应阶段，精子则需要通过乳酸、丙酮酸进行有氧氧化获得能量；精卵融合阶段需要葡萄糖进入磷酸戊糖途径产生NADPH：超常激活时精子酪氨酸磷酸化则需要大量ATP；而精子活力维持似乎只需要较少量ATP。所以，不同阶段精子其代谢途径和所需要的能量底物是不同的(Miki，2007)。1．3．4精子中糖类代谢途径不同条件下，不同物种精子通过不同途径进行能量代谢。第一种：主要靠糖酵解供能。比如人类(PetersonandFreund，1970，1976：Mil(ieta1．，2004)、猪(Kampeta1．，1996：Matineta1．，2003)、绵羊(FordandHarrison，1985)：小鼠(ChinatsuandMakoto，2004)、牛(Krzyzosiaketa1．，1999)精子。第二种：主要靠三羧酸循环供能。比如37℃～34℃条件下，精子能量消耗加大，三羧酸循环就占主导地位(RogersandYanagimachi，1975：HamnerandWilliams，1963：MounibandChang，1964：MurdoehandWhite,1967：Rodriguez，2006：Nevoeta1．，1970：FordandHarrison，1985：Halangketa1．，1985：Folgeroeta1．，1993：Ruizpesinieta1．，1998)。第三种：既能利用糖酵解，也能通过三羧酸循环进行代谢。比如牛和猕猴精子(Turner，2003)。Royetal(1983)的研究表明，37℃、22"(2有氧条件下，牛精子通过糖酵解产生乳酸和ATP，而后在线粒体中进行三羧酸循环、有氧氧化，用以维持活力。第四种：PPP途径。其意义有两方面：一方面，精子通过PPP途径合成大量NADPH，以维持一定的还原状态(Stryer，1995b)．处于还原状态对于精子非常重要，不仅能维持精子氧化还原平衡和适宜pH值，还能调控精子代谢途径使其处于一个适宜的平衡状态，以免出现氧化应激，损伤精子质膜，导致精子死亡(BakerandAitken，2004)．受精过程中，NADPH在NADPH氧化酶催化下产生H202，而H202能硬化受精膜，以阻止多精受精(Swezey，1995)．PPP途径产生的另一个产物就是5．磷酸核糖，主要用来合成核酸，在原核迁移过程中合线期DNA复制需要核酸(Siraeusaeta1．，1975)，此外，小 山东农业大学硕士学位论文．：·．’．。．．鼠2细胞阶段胚胎基因组激活也需要核酸(Flacheta1．，1982)。一糖原磷酸化酶I糖原卜_—————专1．磷酸葡萄糖磷酸二羟丙酮I一!。．。．ADP猡飞ATP6．磷酸果糖七—————_!—-——一辩影1,6-----磷酸果糖1．磷酸果糖油醛《AOP西ATP．．甘二磷量羟丙酮圈1-7果糖、葡萄糖和糖原进入糖酵解途径FlgumI-7Pathwayoffructose，glucoseandglvcogenenterglycoIysb总之，无论是常温、低温液态保存，还是体温条件下的短时间孵育，哺乳动物精子到底使用哪种方式获取能量以维持活力，受许多因素影响，包括稀释液成分、氧气分压、细胞外pH值、精子内部能量需求、动物种类(Stryer，1995b：Rodriguez，2006)、温度(Dziekonskaeta1．，2009)、精子所处的生理阶段(RogersandYanagimachi，1975：HamnerandWilliams，1963：MotmibandChang，1964：MurdochandWhite，1967)等条件影响。而精液保存过程中，不同物种精子所需要的最适温度、稀释液成分都是不同的(Rodriguez，2006)．与此同时，对于同一物种，不同的人其研究结论也不一样，比如猪精子，有人认为主要靠糖酵解(Kampeta1．，1996：Matineta1．，2003)，有人认为有氧氧化则是必需的(Nevoeta1．，1970；‘F0rdandHam'son，1985)。有关山羊精液15℃保存过程中精子的代谢途径研究的几乎没有。1．3．5精子中果糖代谢的研究1945年，Mann首次在山羊和牛的精子中证明了葡萄糖是通过糖酵解过程代谢产生乳 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究酸的。在这篇文章中他还首次提到精浆中分离提纯出了果糖，这项工作在第二年完成并发表了文章(Mann1946b)，在这篇文章中证明了精液中的糖主要是果糖，但是果糖代谢的机制却没有进行深入研究，他只是在文章中提到“果糖通过简单扩散进入精子然后在ATP参与下被己糖激酶催化并最终产生乳酸。”，“葡萄糖、果糖、甘露糖都是在ATP参与下通过己糖激酶催化进入糖酵解代谢，因此精子对他们的利用能力是相等的。”。但是这些陈述都没有证据证明，在以后的文章中也没有被证明(MannandLutwak—Mann·1948)。人们只是简单测定了牛精液中果糖的含量和代谢情况，并模糊的将这种现象称．为果糖酵解。直到1981年Mann出版的书中写到己糖激酶催化果糖磷酸化形成果糖．6．磷酸(MannandLutwak．Mann1981)。在Mann之后涉及果糖代谢的研究或者高度强调Mann的推断(SalisburyandLodge1962；ChertandWhistler1977)，或者完全忽略YMarm的推断(BedfordandHoskins1990；Gitzelmanneta1．1995)。由于不同组织中和果糖代谢相关的酶的差异导致不同组织对果糖的代谢利用情况的不同。但总的来说果糖进入糖酵解的途径可以分为两条：一条存在于肌肉和脂肪，另一条在肝脏。1)在肌肉和脂肪中，果糖能被己糖激酶(它能对葡萄糖和果糖磷酸化>磷酸化形成6一磷酸一果糖(LehningeretaL2000)，然后进入糖酵解途径，进而被磷酸果糖激酶催化形成果糖．1、每二磷酸分解代谢。2)在肝脏中，果糖被果糖激酶催化形成1一磷酸一果糖，随后进入糖酵解途径(Cori●Pfal．1950。果糖代谢的两种产物：果糖．1、6---磷酸和果糖．1．磷酸被醛缩酶进一步代谢，醛缩酶有三种同工酶，醛缩酶A和醛缩酶C催化果糖．1、6．二磷酸裂解为磷酸二羟丙酮和甘油醛．3．磷酸而醛缩酶B催化果糖．1．磷酸的裂解形成磷酸二羟丙酮和甘油醛。果糖代谢的产物，除了甘油醛，是糖酵解．糖异生途径的底物，甘油醛能够被丙糖激酶催化形成甘油醛．3．磷酸，从而进入糖酵解或糖异生途径(HersandKusaka1953)。 山东农业大学硕士学位论文OUts$orbitol‘．FructoseGJucose·：‘jnside：●IVF辱P瞄K，删l：删j酶jElI：el-F魔期d舀喳醣疆’Kev：1If丫nPrOteinhasbeenshownDAP翟DAPL一一inmammaliansperm+———◆+GlyceraldehydeGAPSpermmotility＼厂ADP★圃筹篇fi船r咖ote，删一卜胛、TCAcycle一⋯·PyruvateV：Phosphorylation．．1．4精液质量检测研究进展精液质量检测在临床治疗不孕症以及家畜良种繁殖和育种中具有重要作用。精液检测的目标是快速准确地确定精子的生育力，同时具备多种特性和功能完整的精子才能受精，因而只有同时客观地检测多个指标，才能更好地反映精子的生育能力(采克俊，2003)1．4．1运动能力精子的直线运动能力是评价精子功能最主要的指标。精子拥有较高的运动能力保证了精子在受精过程中与卵子相遇和精子对卵膜的机械穿透作用，因此正确分析精子的直线运动能力具有重要意义(岳焕勋，1993)。通常精子的直线运动能力用精子活力(Spermmotility)来评价，精子活力是指精液中呈直线运动的精子所占的百分比(动物繁殖学)。．精子活力的高低通常是反映精液质量品质高低最直观的指标。目测是最常的观察手段，但受到观察者的经验影响，因此不同观察者或同一观察人员不同次观察会出现较大的差异，精子分析仪的问世使得人们能够客观的测量精子的活力，并能同时对精子运动路径，运动速度和运动状态进行客观的评价。em■If罩鄙、．T．岬◇山≮G．，e曩冒，嬲蛳一5．一册，，P●●●●●山■，oFerS，anⅪO曲U睁 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究1．4．2质膜完整Hoechst33258和PI(碘化丙锭)都是死精子特异性的荧光探针，还有溴化乙锭(EB)、溴乙非啶二聚体(ethidiumhomodimer，EH)等(Pintadoeta1．2．000)。Hoechst33258和PI在荧光显微镜下检测精子脂膜完整都很灵敏，但是两者检测脂膜完整的数值是不相同的，Pl阳性的精子数大于Hoechst33258阳性的精子数(Pinmdoeta1．，2000)。活精子特异性荧光探针有羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CDMFDA)、钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)、和SYBR-14(Garnereta1．，1995a；Thomaseta1．，1997)。一般结合使用这两类染料，从而使死精子和活精子能够同时得到鉴定。SYBR-14和CFDA可用于精子活体染色，而且不影响精子的受精能力和胚胎的发育能力(Garnereta1．，1995b)。活精子特异性荧光探针只能鉴定活精子，因此一般结合PI等死精子特异性荧光探针使用(Garnereta1．，1995a)。Garner等报道应用PI和CFDA技术对冷冻．复苏的牛精子染色，其流式细胞记数仪分析结果与传统精子评价指标高度相关。低渗肿胀实验(HoST)也是评价精子质膜完整性的常用方法。主要是通过检测弯尾率来判定子脂膜完整性。Dl'evius和Eriksson在1966年曾描述过哺乳动物精子弯尾现象(Tailcoiling)(Dreviuseta1．，1966)。当精子被放置到低渗条件下时，水会进入精子内．部并要达到一个平衡，这种内流的水会使精子体积增大、顶体肿胀，尾部弯曲，尾部弯曲这一特征比较明显。因此可以以弯尾率作为评价精子脂膜完整的标志。近些年的研究表明，低渗肿胀实验(HOST)的确有助于预测精子对卵子受精的能力(Correaeta1．，1994)。Kumi等(1993)的研究也证实肿胀弯尾率与精子获能率、穿卵率和精子活力显著相关。Rogers等(1991)发现精子低渗肿胀法的检测结果与精子穿透率的检测结果差异不显著(Rogersetai．。1991)。Jeyendran等(1984)报道，低渗肿胀实验在人精子中应用的很有效，可育组精子肿胀弯尾率(69．13％)明显高于不育组(54．27％，P<0．01)，并且受胎率与精子活力、精子活率及正常形态精子百分率呈明显正相关(Jeyendraaeta1．，1984)．1．4．3受精能力检测’受精能力的检测是决定保存精子能否用于人工授精和实际用于生产的最具有说服力的指标。这项检测能够检测精子与透明带的结合能力、精子穿入去透明带卵子的能力以及使卵子受精的能力和其后胚胎的发育能力以证明精子的功能状态。这种方法更能准确的评价精子的功能状态(Rodriguezeta1．，1997)。 山东农业大学硕士学位论文．-．’·．：．?：．·．．．．’。1．4．4线粒体活性·．‘．．线粒体的主要功能是产生能量，为精子运动提供ATP。因此线粒体的功能状态是精子功能质量的一个关键指标(Dinkinseta1．，2000)。常用的检测线粒体功能的荧光探针有：R．123、MitotrackergreenFM(MITO)和JC．1。Garner等人将3种染料作了比较研究，发现三者都与镜检活动精子百分率高度相关(Garnereta1．，1997)。R-123是一种能渗透入细胞，带阳离子的荧光探针，R-123可检测精子线粒体功能，在精子的线粒体鞘上，在头部质膜，以及尾部非线粒体鞘上也有稍弱的绿色染色的为线粒体有活性的精子(Garnereta1．，1997)·关于果糖代谢的文章大部分都是在室温下研究短时果糖代谢，关于长时间保存过程中果糖代谢的研究比较少，而且还是在低pH条件下研究果糖代谢；另外我们首次将山羊精液液态保存时间延长到16天活力仍能维持30％以上，而还没有人用这么保存这么长时间的精液进行过人工输精，这些都需要研究。1．5本研究目的意义和主要内容．设计精液保存液配方需要考虑精子能量代谢因素，否则，设计的稀释液配方会因为缺乏能量物质而维持精子存活的时间很短，缩短精子维持有效受精能力的时间缩短‘，限制稀释液应用与推广。若能运用成分简单明确的培养液构建一个成熟的体外保存系统，将为山羊精子代谢机理研究搭建一个创新平台。我们在实验室pH6．25的MES稀释液卵黄包被条件下保存山羊精液16天活力仍能维持在30％以上这一结论的前提下，希望借助pH6．25这一低pH条件加上MES缓冲能力比较强的优势，构建一个比较简单的盐溶液但还能长时间保存山羊精液，达到长时间研究山羊精液中果糖的作用及其作用途径等问题，以丰富“精子代谢机理”基础理论，为动物生产和医学临床提供理论依据。2010年我们实验室用MES卵黄包被液态保存山羊精液维持30％以上活力的时间达到了16天，我们在这一研究结果的基础上，采用阴道海绵栓对实验羊只进行同期发情处理，并在撤栓后观察羊只的发情情况，确定输精时间并及时进行输精操作。在输精后‘及时观察羊的返情、妊娠情况，确定一个最佳输精时间，以期最终为生产实践服务，● 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究-：·．‘．。·．2材料与方法．2．1实验药品葡萄糖(Glucose)，果糖(Frucose)，NaCI、柠檬酸钠、聚乙烯醇(PVA)、EDTA、碳酸氢钠(NaHC03)、氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)、磷酸氢二钠(Na2HP04)、磷酸氢二钾(NaH2PO,)、KCI、柠檬酸三钠盐、青霉素钠、硫酸链霉素、乳酸钠(sodiumlactate)、柠檬酸钠、EDTA、KCI、柠檬酸三钠盐、EDTA、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA),碘醋酸酯(Iodoaeetate)、青霉素钠、MESsodi啪(2．吗啉乙基磺酸钠)、硫酸链霉素、乳酸钠(sodiumlactate)等是Sigma公司产品，其它药品均为国产。在这里我们将以MES钠盐为缓冲系统配置的保存液定义为简易MES稀释液，并以此作为基础液进行实验，记作BM液(basicmedium，BM)，以和刘长河的MES稀释液相区分。试剂配制所用水均为MILLIPOREMilli．Q纯水仪制备的超纯水。BM液配方：表IBM配方Table1IngredientofBMbuffersaline2．2实验动物．本实验采用五只年龄在2—3．岁健康鲁北白山羊，所有羊只都具有正常的性欲及配种能力。山羊饲以晾干粉碎的花生秧，自由采食，另外补充部分精饲料，微量元素及青绿饲料，并为羊只提供清洁的饮水。2．3精液的采集与稀释、运回与储藏用假阴道法采精，采精后立即观察精液外观性状并在光学显微镜下检查精液质量，16 山东农业大学硕士学位论文．只有精液颜色正常，有云雾状，精子活力在90％以上时．，才用于实验。质量合格的精液，立即用35"12的稀释液l：10稀释并进行分装，分装用1．5ml离心管，每只分装0．55ml稀释后的精液。精子的包被处理：利用MES稀释液为基础液制作20％卵黄包被液，采精后新鲜精液与包被液l：1稀释进行离心，离心条件：30"C、200xg、离心10分钟，去上清，然后利用MESI，10稀释稀释并进行分装，每只分装0．55ml稀释后的精液。稀释后的精液用装有30℃温水的保温瓶水浴保温，在40--50min内带回实验室。带回后立即实施降温，降温采用200ml水浴5"C冰箱中自然降温。质量合格的精液，立即用3012的BM稀释液l：1混匀，在3712、180xg条件下离心lO分钟，去掉上清；将离心后的精液再用30"C的BM稀释液l：l混匀，在3712、180xg条件下离心lO分钟，去掉上清，经过两次离心洗涤后的精子团块确保没有来自精浆中的果糖对实验产生影响。离心后的精液，立即用35℃的BM稀释液l：10稀释并进行分装，分装用0．5ml离心管，每只分装0．3ml稀释后的精液。稀释后的精液用装有30℃温水的保温瓶水浴保温，在40--50min内带回实验室。带回后立即实施降温，降温采用200ml水浴特定温度冰箱中自然降温。2．4精液分装与运输稀释后的精液用装有30"C温水的保温瓶水浴40．50min带回实验室，到达实验室后立即将稀释好的精液进行分装。。2．S精液的降温与保存精液分装后立即实施降温，降温采用200ml水浴自然降温。200ml水浴降温即用200ml烧杯装上200ml3012的水然后把装有分装好的精液的离心管插到泡沫上，把泡沫放到装有30"C的温水的水面上，使离心管浸入到30℃的温水中，并且保证精液液面位于水面以下，然后放入生化培养箱中降温并保存，保存期间不换液。．2．6保存精液的质量检测‘●-●稀释分装好的精液从30"C降到预定温度后开始计算保存时间，即：第0天活力均是在温度从30。C降温至设定温度后的检测值，保存24h的记为l天，以下以此类推。根据实验要求抽检精子的活力、活率。在各实验组的精液中混匀后取出100肛1，放入200p1预热到37．5℃的pH值为7．0的mZAP中孵育20min，混匀后，用西班牙进121精子分析17 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究．仪在10．0倍光镜下，利用SCA软件检测活力，热台的温度是37"C。根据WHO(世界卫生组织)标准设计参数，精子运动分a、b、c和d级，。Typea：Rapidlyprogressivespermatozoa：Typeb：Slowlyprogressivespermatozoa：Typec：Non-progressivespermatozoa(movingbutnotinthecorrectway)：Typed-Immotilespermatozoa(thatdoesn’tmealldead)。其中活力是指a+b；活率是指a+b+“2．7同期发情海绵栓在使用前，我们先向轻质石蜡油添加适量青、链霉素双抗，搅拌、混匀。海绵栓在使用时先在石蜡油中浸润，一人先将母羊绑定，放栓者用利用自制放栓枪将阴道海绵栓放入母羊阴道。以放栓当天记为Od，在第12天下午撤栓，去栓时，抓紧海绵栓的系绳，直接将海绵栓从母羊阴道拔出，个别不能正常从阴道内拔出的海绵栓，采用开腔器打开阴道，用长柄镊子取出，取出栓后用含适宜浓度双抗的清水冲洗阴道，消除并防止炎症的出现。2．8人工输精2．8．1发情鉴定用公羊试情，抓出愿接受公羊爬跨和主动接近公羊的母羊，结合母羊阴道粘液状况及子宫颈口开张情况，确定适宜的输精时间。如果母羊外阴粘液量多、粘稠，子宫颈口开张较好，适宜马上输精。如果外阴部粘液很少，子宫颈口开张差，需继续观察，进一步确定。如果外阴部粘液发黄或干成痂块，则发情己过，不能输精。2．8．2输精采用倒提后腿法输精。用保存的精液每次输精有效精子数不少于5000万，输精深度要在于宫颈口内0．5cm—lcm，动作要轻。选择输精时间，山羊发情持续时间为一般为30一40小时。最佳输精应在发情母羊变得安静，拒绝爬跨，也就是在发情后25—30小时输精。这时母羊发生排卵，易于受胎。每天观察发情两次。为方便起见如上午发现母羊发情，当晚第一次输精，次日早晨第二次输精。下午发现发情，次日早晨第一次输精，晚上第二次输精。输精后，做好记录。珀 山东农业大学硕士学位论文2．8．3妊娠观察．．．2．对配种的母羊观察一个情期(20天左右)，并结合B超仪进行妊娠诊断，观察羊只妊娠情况，做好返情的补配并做好记录。2．9实验设计2．9．1BM液保存山羊精液最佳温度的筛选我们比较理想的研究山羊精子代谢的条件是既要尽可能长时间的保存精液，精子又要有一定的代谢活动。为此，我们选了了5"0、15"(2、25"(2---个温度进行筛选，选择一个最佳的保存温度进行研究。2．9．2最佳果糖浓度的确定以只含四种盐成分的简易MES稀释液为基础液，研究了稀释液中添加不同浓度果糖对精子的影响。2．9．3添加碘醋酸酯阻断葡萄糖糖酵解代谢途径对山羊精子的影响在含有3mM的Ca、Mgfreed．DPBS培养液中分别添加不同浓度糖酵解抑制剂碘醋酸酯(Iodoacetate)，检测精子活力和保存效果，确定糖酵解途径在精子果糖代谢中的作用。。2．9．4添加脱氢表雄酮阻断葡萄糖磷酸戊糖途径对山羊精子的影响在含有10mM果糖的BM液中分别添加不同浓度PPP途径抑制剂脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)，检测精子活力和保存效果，确定PPP途径在精子果糖代谢中是否起作用。2．9．520％卵黄包被液离心后再对精液进行包被对精液保存的影响由于在实验中我们无法控制实验羊只、卵黄方面的带来的影响，在做卵黄包被实验的时候会有细菌污染的危险，这对输精是不利的；O．Veto．Munoz等(2009)年发表的．文章中他们提到卵黄中起主要作用的是低密度脂蛋I刍(LDL)，所以我们考虑对配制的20％卵黄包被液离心．取上清进行卵黄包被，看和不离心条件下保存效果是否有差异。．2．9．6MES卵黄包被精液的人工输精我们首先考虑将保存15、16天的精液以及鲜精用于人工输精，如果不能取得比较理想的效果，我们考虑将保存时间往前提，再用保存12、13、14天的精液进行输精。’19 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究●2。10统计分析实验数据利用SPSS统计软件的ANOVA模块分析。数据先经LSD转换后进行单因素方差分析，p<0．05为差异显著。所有实验至少重复3次以上。表中数据均采用平均数4-标准误(mean-q：SE)表示。 山东农业大学硕：t学位论文3结果与分析3．1山羊精液最佳保存温度的筛选2009年我们实验室在mZAP卵黄包被山羊精液后保存13天活力维持30％以上的基础上，以缓冲能力更强的吗啉乙磺酸钠盐(MESsodium)缓冲盐代替HEPES制成Ph6．25的MES稀释液卵黄包被后维持30％以上活力的时间延长到了16天，这就为山羊精液液态保存研究提供了一个非常好的基础；2010年时我们实验室用简易PBS在15℃条件下成功保存山羊精液，第7天活力仍能维持在30％以上，并在此基础上进行了葡萄糖代谢的相关研究，这都为我们研究山羊果糖代谢提供了依据，为此我们首先用MESsodium、Nacl、聚乙烯醇(PVA)、EDTA·4Na配置了一种简单不含能量的MES稀释液，研究了不同温度下山羊精液的保存效果，以期选择一个既能长时间维持精子存活又能保持一定代谢强度的温度，为后面研究精子中果糖的代谢做铺垫。我们将采得的符合要求的精液立即用30℃的BM稀释液l：l混匀，在37℃、180xg条件下离心10分钟，去掉上清：将离心后的精液再用30℃的BM稀释液l：l混匀，在37"0、180xg条件下离心10分钟，去掉上清，经过两次离心洗涤后的精子团块立即用BM稀释液l：lO稀释，并分装保存，观察保存期间精子活力的变化以及不同温度时保存时间的差异。每个实验至少重复6次。结果见表l。表I在不同保存温度对山羊精子的影响．TablelSpermmotilityafterstorageatdifferenttemperature．a'b：同一列中含不个罕母的两项之同差异显著(p<0．05)如：Valueswithoutacommonletterintheirsuperscriptsdiffer(P．(0．05)withincolumns．从表中的结果可以看出在5"0、15℃都能取得比较长时间的保存效果，在25℃条件下精子活力迅速下降，只是在采精当天活力能维持30％以上，保存的第一天活力就降到30％以下了，明显不符合长时间研究代谢的要求；在5℃、15"0条件下都能取得一个相对比较长的保存时间，相对5"0条件下而言，在15"0条件下精子更能维持一个相对比较高的代谢活性，而且15．0相对保存效果要稍微好一点。从表l我们可以得出这样的结论： 用MEs稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究在15。C条件下研究果糖代谢是一个比较理想的温度，在我们接下来的实验中我们都采用了l5℃这一温度条件。3．215℃条件下添加不同浓度果糖对精子存活率的影响采得的精液立即用30"C的BM稀释液l：l混匀，在37"C、180xg条件下离心10分钟，去掉上清：将离心后的精液再用30‘C的BM稀释液l：1混匀，在37"C、180×g条件下离心10分钟，去掉上清，经过两次离心洗涤后的精子团块分别用用BM稀释液、添加不同浓度果糖的BM稀释液1：10稀释，并分装保存，观察保存期间精子活力的变化，确定果糖在精子中的作用以及精液保存过程中最佳的果糖浓度。每个实验至少重复6次。结果见表2。表2156C条件下pH6．25的IVIES中添加不同浓度果糖对山羊精子活力的影响Table2EffectsofdifferentconcentrationoffructoseinpH6．25IVIESextenderongoatspermmotilityduringliquidstorageat15℃a-c：同一列中雷不个罕母的两项之同差异显看(p<0．05)H：Valueswithoutacommonletterintheirsuperscriptsdiffer(P∞．05)withincolumns．从表5中我们可以看出，与不添加果糖的对照组相比，稀释液中添加10mM／L果糖后，保存至第3天时精子活力显著升高，能达到61％，与不添加葡萄糖相比差异显著，显著改善了保存效果，最终保存期限(活力>30％)能达6d，比对照组延长了3d：当稀释液中添加果糖浓度从0增加到10mM／L时，精液保存效果明显提高并在10mM／L时取得最佳保存效果；而当稀释液中果糖浓度超过10mM逐渐增大时，保存效果又降低。从表2中我们筛选出果糖的最佳浓度是10m．MA,。．3．3添加碘醋酸酯阻断葡萄糖糖酵解代谢途径对山羊精子的影响从上面的实验我们可以看出稀释液中果糖的浓度影响精子存活率，稀释液中果糖的浓度并非是越多越好，而是有一定的浓度限度，这可能与精子代谢利用果糖的能力以及代谢途径有关。为了深入了解山羊精子的代谢途径和机理，我们进行了有关代谢途径方22 山东农业大学硕士学位论文．．．一·．!．．·．．．．．‘‘面的研究。我们检测了糖酵解途径在山羊精子代谢过程中是否占主导。我们以添加或不添加10mM果糖的简易MES为基础稀释液，研究了添加不同浓度糖酵解抑制剂碘醋酸酯(Iodoacetate)对山羊精液保存效果和精子存活率的影响。为了研究糖酵解途径在山羊精子代谢过程中的左右。我们首先用BM稀释液对精液进行洗涤除去精浆中存在的果糖对实验可能产生的影响，然后分别用BM稀释液、添加10mM果糖的BM稀释液、以及添加不同浓度碘醋酸酯的10mM／L果糖的BM稀释液对离心后的精液l：10稀释，分装保存，观察保存期间山羊精液活力的变化情况，研究添加不同浓度糖酵解抑制剂碘醋酸酯(10doacetate)对山羊精液活力的影响。每个实验至少重复6次。表3在含10mM果糖的PH6．25的MES中添加不同浓度lodoacetate对山羊精子活力的影响EffectsofsupplementdifferentconcentrationsofDHEAinpH6．25MESextenderwith10mMfructoseOngoatspermmotilityduringliquidstorageofsemenwhenthe9硼∞isstoredat15"Ca-d：同一列中含不个早母的两项ZI司差异显看(p<0．05)·a-d：ValueswitIloutacommonletterintheirsuperscriptsdiffer(P《o．05)withincolumns‘从表3中的结果我们可以看出：在添加果糖的条件下，再添加不同浓度的Iodoacetate能显著缩短精液保存时间，说明添加Iodoacetate后阻断了山羊精子的糖酵解途径，导致山羊精子的能量减少，从而降低了精子活力，缩短了保存时间。同时，我们在不添加果糖的条件下，添加lodoacetate并没有影响精液保存效果，和对照组不添加Iodoacetate相比相同天数的精子活力也没有差异，说明添加的Iodoacetate对山羊精子没有产生毒性，从而排除了Iodoacetate对山羊精子可能产生的毒性而导致精子活力低下的不利因素。总之，通过这个试验我们可以得出以下结论：山羊精液液态保存过程中，糖酵解途 用MF．S稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究径在山羊精子代谢中发挥着很大作用：．‘3．4添加脱氢表雄酮(DHEA)阻断果糖磷酸戊糖支路对山羊精子的影响●我们首先以BM稀释液对精液进行洗涤除去精浆中存在的果糖对实验可能产生的影响，然后分别用BM稀释液、添加10raM果糖的BM稀释液、以及添加不同浓度脱氢表雄酮(DHEA)的10mM／L果糖的BM稀释液对离心后的精液1：lO稀释，分装保存，观察保存期间山羊精液活力的变化情况，研究磷酸戊糖途径抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)对山羊精液保存效果和精子存活率的影响。每个实验至少重复6次。表4在含10mM果糖的PH6．25的MES中添加不同浓度的DHEA对山羊精子活力的影响Table4EffectsofsupplementdifferentconcentrationsofDHEAinpH6．25IVIESextenderwithiOmMfructoseongoatspermmotilityduringliquidstorageofsemenwhenthesemenis=oredat15"Ca’b：同一列中含不个孚母的两项之问差异显著(p<0．05)a’b：Values、ⅣinIoIItacommonletterintheirsuperscriptsdiffer(P司0．05)withincolumns从表4的结果可以看出，在添加了10mM／L果糖的BM稀释液，再添加不同浓度的DHEA对精子活力产生了一定的影响，说明添加DHEA后在一定程度上阻断了山羊精子对添加的果糖的磷酸戊糖途径，对山羊精液保存时间和精子活力产生了一定的影响，但是我们还没来得急在不添加果糖的对照组中添加DHEA是不是能够影响精液的保存，以排除是不是DHEA本身毒性的原因对精子活力产生的影响。3．5pH6．25MES稀释液卵黄包被后对山羊精液的保存效果为了完成后面输精的工作，我们首先重复了刘长河用pH6．25的MES稀释液保存山羊精液的实验。将采得的精液包被后用pH6．25的MES稀释液l：10稀释，每天检测其活力。从表5中我们可以看出用MES稀释液卵黄包被后的精液完全能保存到16天，而且16天时活力仍能维持在30％以上。后面一栏为我们重复前面的结果，每个实验至少．重复6次。这为我们后面人工输精工作进行了铺垫。 山东农业大学硕士学位论文．：：．·．．’一表5卵黄包被，pH6．25的MES保存山羊槽液的效果Table5EffectofMESinpH6．25withcoating+每列中字母相同者爱不差异未达显看水平(P>o．05)，字母不同者表不差异达显著水平(P《o．05)．‘Valueswithoutacommoltsupersmptletterinthesamecolumndifferwithindaysofstorage(p<0．05)3．620％卵黄包被液离心后对山羊精液的保存效果由于在实验中我们无法控制实验羊只、卵黄方面的带来的影响，在做卵黄包被实验的时候会有细菌污染的危险，这对输精是不利的：而且我们曾经将用75％酒精浸泡过夜的鸡蛋制备的20％包被液在37"(3温箱中培养2小时，将包被液拿出后在显微镜下看到包被液中长满了细菌，而卵黄中的细菌是没有办法去除干净的。所以我们考虑消除这种危害，在O．Vem．Munoz等(2009)年发表的文章中他们提到卵黄中起主要作用的是低密度脂蛋白(LDL)，所以我们考虑对配制的20％卵黄包被液离心，取上清进行卵黄包被，看和不离心条件下保存效果是否有差异。．我们首先在200xg离心力条件下离心，取上清，然后用上清对采得的精液进行包被离心并按1：10稀释后分装保存，并检测每天的活力变化情况，每个实验至少重复6次。结果见表2。从表6中我们可以看出卵黄包被液离心后同样能够取得比较好的保存效果，在这里我们强调鸡蛋的新鲜，越新鲜的鸡蛋效果越好，我们在实验中曾经用过不是太新鲜的鸡蛋，结果维持30％以上活力的时间只有lO-12天左右，而且采得的精液在降温到512时第O天的活力只有80％．85％左右，明显比没离心的卵黄包被液包被后的效果差，而且保存的精液的运动速率也差很多，这部分数据没有写进论文中。‘ 用MES稀释液液态保存山羊精液果糖代谢的研究··．．：．‘．。．‘表620％卵黄包被液离心后进行卵黄包被对保存山羊精液的效果●Table6EffectofMESinpH6．25withcoating·每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>o．05)．字母不同者表示差异达显著水平(P<0．05)．Valueswithoutacommonsuperscriptletterinthe姗columndifferwithindaysofstorage(p