月月粉丁香酚合成酶基因rcegs1的克隆及分析

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1、华中农业大学硕士学位论文月月粉丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及分析姓名：王海萍申请学位级别：硕士专业：园林植物与观赏园艺指导教师：唐开学201206月月粉丁香酚合成酶基因RcEGSl的克隆及分析摘要丁香酚(Eugen01)是月月粉(Rosachinensis‘Pallida’)重要的花香成分之一，具有浓郁的丁香气味。前人研究表明，丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferylacetate)为底物，由丁香酚合成酶催化形成的。克隆分析月季丁香酚合成酶基因，不仅有利于明确丁香酚合成酶基因在花香调控中的作用，而且为利用转基因技术培育具有香味的月季品种提供候选基因。本文以

2、古老月季品种月月粉为材料，利用RT．PCR结合RACE—PCR技术，克隆了月月粉尺止GS，基因，并运用实时荧光定量PCR法进行了该基因在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达分析。将RcEGSl基因的完整编码框通过酶切、连接转到植物表达载体pBIA31中，构建了植物表达载体pBIA31．RcEGSl，采用农杆菌介导的叶盘法成功转化矮牵牛。本研究结果为进一步对RcEGSl进行功能验证和深入探讨月季苯基丙烯类物质代谢路径奠定基础。具体研究结果如下：1．利用GenBank发表的丁香酚合成酶基因的氨基酸保守序列设计引物，用同源克隆法和RACE．PCR技术，从中国古老月季

3、月月粉盛开期的花瓣中获得了一个新的月季丁香酚合成酶基因，命名为RcEGSl，GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为1171bp，开放阅读框(ORF)95lbp，编码317个氨基酸，具有EGS基因的保守结构域KQVDVVIS和KIIAAIK；其蛋白质理论分子量为35．64kD，等电点为7．36。氨基酸同源序列比较发现，月季RcEGSl与矮牵牛PhlGSl的氨基酸保守区同源性最高，具有70％同源性，与罗勒ObEGSl同源性达59％，与月季RhEGSl的同源性为48％。2．运用实时荧光定量PCR法对月月粉6个不同发育时期的花朵和4个不同组织部位进行分析，

4、发现RcEGSl基因在花瓣、萼片中有表达，在叶片、茎段中没有表达，以花瓣中的表达量为最高，且在花蕾期没有表达，在盛开期的表达量最高，凋谢期表达量较低。即该基因的表达和月季花香物质释放量呈现一致的规律。3．用SmaI、Sail双酶切质粒pMDl8-RcEGSI和表达载体pBIA31，将回收的全长基因片段和pBIA31大片段，用T4DNA连接酶连接，转化感受态细胞Trans50t，对重组子茵液进行PCR扩增和双酶切鉴定，电泳获得预期约1000bp的条带，说明已成功构建了植物表达载体pBIA31-RcEGSl。华中农业大学2012届硕士研究生学位论文4．将构建好的重组

5、质粒转化根瘤农杆菌LBA4404感受态细胞，采用叶盘法转化无菌矮牵牛的幼嫩叶片。经过共培养和抗性筛选，提取再生植株的叶中DNA，进行PCR检测，初步证实得到7个阳性再生植株。关键词：月月粉；花香；丁香酚合成酶基因；实时定量PCR；表达载体构建；转化月月粉丁香酚合成酶基因RcEGSI的克隆及分析AbstractEugenolisanimportantfragrantcomponentinRosachinensis‘Pallida’，withs仃ongodorofclove．Itwasreposedthatconiferylalcoholservedasthesub

6、strateofEugenolsynthase(EGS)．TocloneandanalyzeeugenolsynthasegeneinR．chinensis‘Pallida’，cannotonlylayafoundationfortheresearchofsynthesispathwayofkeysynthasegenesinrose，andprovidecandidategenesforrose—scentbreeding．AneweugenolsynthasegenenamedRcEGSlwasclonedfromthepemlofRchinensis‘Pa

7、llida’byRT-PCRandRACE—PCR，theexpressionprofileofRcEGSlofRoseflowerwasanalyzedbyquantitativeRealTimePCRindifferenttissuesanddifferentdevelopmentalstages．AplantexpressionvectorpBIA31-RcEGSlwasconstructedbyinsertingtheOpenReadingFrame(ORF)ofRcEGSlbydigestionandligationandtransferredinto

8、petuniahybri