中国黄土高原苹果产区土壤真菌群落多样性及生防放线菌菌株筛选

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1、山东农业大学硕士学位论文中国黄土高原苹果产区土壤真菌群落多样性及生防放线菌菌株筛选姓名：孙海涛申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：于金凤20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要我国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的’40％以上，在世界苹果产业中占有重要地位。黄土高原地区是我国苹果主要栽植区，苹果栽培历史悠久，在生产中面临的主要问题是老果园的更新及新果园的建立，由于土地资源有限，很多果园是在老果园中进行换茬更新，由此引起的苹果重茬障碍成为苹果园更新换茬的主要限制因素。果园重茬障碍是影响果树发展的世界性难题，研究

2、其发生机理及其控制技术也是果树栽培技术研究领域的重要内容。本研究对黄土高原地区老果园及重茬果园土壤真菌的群落结构进行分析，具体结果有以下几个方面：1．从黄土高原地区8个县区分两批采集的共84份土壤样品(每批42份)中分离纯化得到土壤真菌16属，利用物种丰富度、Shannon—Wiener多样性指数、均匀度和种群优势度等指标对黄土高原地区的8个县区的土壤真菌的群落结构分别进行分析，结果表明：土壤真菌的数量和类群分布在该地区不同果园土壤中存在较明显的差异。在不同县区中，果园土壤真菌的种类和数量及群落多样性指数存在较明显的差异，但总体趋势始终是老果园行内土壤真菌

3、的物种总数和物种数量最高，大多数重茬果园的物种总数、物种数量和均匀度最低。而老果园行间和小麦正茬土壤真菌的多样性指数和均匀度变化较大，无明显规律性。同一县区中，老果园行内土壤真菌的物种多样性指数、均匀度明显高于重茬果园。上述结果说明，老果园行内的真菌群落结构趋于稳定，是经过多年的微生物间相互适应及协同进化等因素使土壤真菌不同物种间达到一个相对稳定的平衡状态。而重茬果园由于老果树的移开，使真菌群落的结构遭到不同程度的破坏，真菌群落结构失衡，可能是造成苹果园重茬障碍的一个重要因素。2．分别对比分析8个县区土壤真菌的物种组成规律，结果表明，老果园行内土壤中具有生

4、防作用的木霉属和粘帚霉属真菌数量占整体物种百分数高于重茬果园；而重茬果园土壤中具有较强致病性的镰孢属和轮枝孢属真菌数量所占整体物种百分数高于老果园，这说明，重茬园中某些具有致病作用的真菌类群数量相对增多，同时具有生防作用的真菌类群的相对降低是造成重茬障碍的关键因素之一。而镰孢属和轮枝孢真菌可能是黄土高原地区重茬果园果树重茬病害的主要致病菌。3．为了进一步验证常规土壤真菌分离方法对土壤真菌群落多样性分析的可靠性，对第二批采集的42个土壤样品在进行常规分析的基础上又利用PCR-DGGE技术对该地区土壤中真菌多样性进行了分析。通过试剂盒提取的土壤微生物总基因组D

5、NA片段在中国黄土高原苹果产区土壤真菌群落多样性及生防放线菌菌株筛选17kb左右，使用带有“GC"夹子的引物进行PCR扩增以后获得扩增片段在230bp左右。结果表明，同一个地区内，老果树行内的土壤微生物获得的条带数量最多，而重茬果园的土壤微生物获得的条带数量最少，老果树行间和小麦正茬的土壤微生物获得的条带数量波动较大。依据不同地区苹果园土壤真菌群落结构的相似性构建聚类分析树可以看出，同一地区，重茬果园的土壤真菌结构相似性很高，同时老果园行内的土壤真菌的相似性也很高。此分析结果与常规土壤真菌分离方法进行的多样性分析结果具有相似的趋势。4．利用稀释平板法从采集

6、的土样中还分离得至aJ513株放线菌菌株。室内对峙培养法选择了对4种致病镰孢菌(尖孢镰孢菌Foxysporum、层出镰孢菌Fproliferatum、腐皮镰孢菌Fsolani和串珠镰孢菌Fmoniliforme。)有较好防治效果的放线菌菌株2l株。对1株立枯丝核菌(RhizoctomiasolaniAG4)有较好生防效果的放线菌菌株6株。其中菌株35—5抗菌谱较广，对实验真菌生防效果好；对层出镰孢菌抑制效果较好的放线菌菌株有35．7、25．15、18．5；对串珠镰孢菌抑制效果较好的放线菌菌株有24．6、37．12、35．5：对尖孢镰孢菌抑制效果较好的放线菌

7、菌株有33．8；而此次实验未筛出对腐皮镰孢茵有理想抑制效果的放线茵菌株。37．12和24_6两株放线菌菌株对丝核菌的抑制效果最强。5．综合考虑各放线菌菌株对测试菌株的抑制效果，从中选出9株土壤放线菌菌株，采用生长速率法对9株放线菌的发酵液进行抑菌活性复筛，结果表明，放线菌菌株37一12对立枯丝核菌的抑制率达到95％，而且对其他测试菌的抑制率也达到50％以上，具有较高的广谱生防效果。其次是放线茵菌株24石，对测试菌抑制率达到40％一80％。6．利用16SrDNA区序列分析方法对放线菌菌株24—6和37．12进行了序列测定，利用Balst方法在GenBank中

8、进行序列比对，结果表明，2株放线菌菌株都是属于链霉菌属。关键词：土