新合成查尔酮类衍生物的抗炎活性评价及药理机制研究

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1、温州医学院硕士学位论文新合成查尔酮类衍生物的抗炎活性评价及药理机制研究姓名：李建领申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：李校堃；梁广2012-05-22温州医学院硕士学位论文新合成查尔酮类衍生物的抗炎活性评价及药理机制研究摘要目的：1．天然存在的查尔酮类化合物活性都较低，明显限制它的应用。我们设计合成系列查尔酮类似物，在于提高活性。2．设计通过新合成查尔酮类似物，阻断脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264．7释放典型炎症因子白细胞介素．6和肿瘤坏死因子，评价它们的活性大小。3．设计脂多糖诱导小鼠腹腔原代巨噬细胞炎症反应，检测新

2、合成查尔酮类似物抑制炎症因子转录水平及对核转录因子NF一1cB信号通路相关蛋白激酶磷酸化水平的抑制。4．通过小鼠腹腔注射LPS20mg／kg造成脓毒感染性休克模型。检测新合成查尔酮化合物体内抗炎活性。方法：主要的抗炎药物，甾体类和环氧化酶类，己被证实有各种副作用，如COX．1和COX．2的抑制作用无选择性，如吲哚美辛等即抑制COX．2，也抑制COX-1，甚至对COX．1的抑制作用比对COX．2的抑制作用还要强许多，因此会引起较严重的肠胃道损伤。长期服用非甾体类抗炎药的病人中，有12．30％出现胃溃疡，2．19％出现十二指肠溃疡

3、，而原有溃疡病者，症状则会加重。通过在A环和B环上引入不同的基团，我们合成一系列的查尔酮类似物。见图1：RoO图1查尔酮类似物合成路线Figure1Syntheticrouteofchalconederivatives1．化合物抗炎活性的筛选：各个化合物对LPS刺激巨噬细胞所释放的炎症因子n师．Q，IL-6的作用，逋过应用ELISA方法来表征。并将活性较好的六个化合物L6H3，L6H4,L6H9，L28H2，L40H16，L6H21稀释成2．5，5，10，20mM等四个浓度进行量效关系研究。2．Westernblot方法分析：

4、收集处理的细胞并裂解，挑选40pg的细胞总裂解液，通过10％十二烷基硫温州医学院硕士!学位论文酸盐-聚丙烯酰胺凝胶柱分离，随后电转到硝酸纤维素膜上。每张膜在室温条件下，预先在pH7．6、含O．05％吐温20、5％脱脂牛的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中孵育一个小时。分别用p-JNK，JNK，Ird3，p-p38，p38，P．ERK，ERK或者Actin等的特异性抗体反应孵育硝酸纤维素膜。免疫反应的条带和二抗(含有辣根过氧化物酶标记)结合后用加强的化学发光试剂成像。3．分析细胞核NF．KBP．65转移：根据试剂制造商提供的细胞核NF．

5、KBP．65试剂盒说明书，对细胞进行免疫荧光染色。细胞内的P65蛋白和细胞核分别被染成红色或者是蓝色，且在荧光显微镜下可被明显观察到，在其激发光光波长为350nm时观察到DAPI，在波长540nm处可以看到抗兔Cy3抗体。当把蘸张红、蓝图片重重叠在一起，在红蓝重合的位置，呈现出来紫色的荧光图像。4．脂多糖诱导B6小鼠炎症死亡率：在37℃水浴条件下，将化合物溶解到含有链甘油三酯的聚乙二醇中。化合物浓度，调节成2mg／mL。在最终溶液中溶剂的浓度范围是5～10％，中链甘油三酯的浓度时0．5～2％。体重范围在18．229的雄性B6小

6、鼠，先静脉注射化合物水溶液200pL、15mg瓜g，而对照组注射空白溶液，阳性对照组按照LPS20mg&g进行注射。连续7天不断检测记录实验小鼠的体重和死亡率。5．实时定量PCR方法：依据试剂商的操作手册，用TRIZOL试剂盒处理实验细胞。逆转录和荧光实时定量检测法，应用两步法M．MLV，SYBRGreenqPCRSuperMix．UDG试剂盒。使用EppendorfMastercyclereprealplex检测系统分析Q．PCR定量结果，TNF．0【，IL．6，IL．12，IL—lp，COX．2和B．actin等的引物委托

7、Invitrogen公司合成。结果：QSAR研究发现在B环上存在有吸电子基团，或者是在A环上有供电子基团时，查尔酮类化合物能够显著抑制脂多糖诱导的IL．6的表达。此外化合物L6H3，L6H4，L6H9，L6H21，L28H2呈现剂量依赖性抑制TNF．a和IL．6的表达。同时L6H3，L6H4，L6H9，L6H21等六个化合物，能显著降低LPS诱导的TNF川，IL．1B，IL．6，IL-12和COX．2mRNA上调。在作用机制方面L6H4，L6H9和L6H21干扰JNK／NF．迎信号通路，剂量依赖性的阻断ERK，p38和jnk激

8、活。另外L6H4，L6H9和L6H21可有效的减少LPS诱导的脓毒性休克导致的死亡。L6H4，L6H9可以阻断高糖诱导的炎症细胞因子的释放。关键词：查尔酮；抗炎；核转录因子NF。1(B；量效关系分析温州医学院硕士学位论文EvaluationandPharmacological