小鹅瘟病毒vp3基因的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制

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1、小鹅瘟病毒VP3基因的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制ExpressionofGoslingPlagueVirusVP3geneandDevelopmentofMonoclonalAntibodiesagainstGPV研究生：鹿钟文导师：秦爱建教授基金项目：国家农业部公益性行业科研专项子课题小鹅瘟快速诊断与疫苗研制201003012教育部创新团队(1RT0978)江苏省优势学科建设项目扬州大学2012年5月鹿钟文：小鹅瘟病毒VP3基冈的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单氟隆抗体的研制小鹅瘟病毒VP3基因的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制研究生：鹿钟文导师：秦爱建教授摘要鹅细小病毒感染

2、(GooseParvovirusInfection)，又称为小鹅瘟(Goslingplaque)，是由鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)引起的一种急性、高度接触性、败血性传染病。主要侵害30日龄以内雏鹅和雏番鸭，以渗出性肠炎、心、肝、肾等实质器官炎症为特征，致病性强，死亡率高，是目前危害养鹅业的主要疾病之一。本研究对GPV疫苗株SYG61和流行株P．1的VP3基因进行了克隆测序及序列比较分析，进而对两者的部分生物学特性进行了比较研究，并应用杆状病毒表达系统对GPV疫苗株SYG61的VP3基因进行了表达：利用GPVSYG61免疫BalB／c小鼠，制备了2株抗GPV的单克隆

3、抗体，为GPV的检测和防治提供了优良的生物学材料。1．小鹅瘟病毒VP3基因的克隆与表达本研究对GPV疫苗株SYG61和流行株P．1的VP3基因进行克隆测序及序列比较分析，测序结果表明，两株不同GPV毒株的VP3基因核苷酸序列长均为1605bp，编码534个氨基酸。序列对比结果显示，两株不同GPV毒株的VP3基因核苷酸同源性为95．8％，氨基酸同源性为98．1％。与GenBank上发表的国内外其他GPV毒株的核苷酸同源性为93．6％．99．9％，氨基酸同源性为96。3％～99．8％。虽然GPV疫苗株SYG61和流行株P．1的VP3基因同源性较高，但从进化树分析来看，仍表现出一定的地区差异性

4、。ELDso和LDs0的测定结果为GPVE1株对鹅胚的半数致死量(ELD50)为10‘5～9／0．2mL，对雏鹅的半数致死量(LD50)为10。233／0．2mL；GPVSYG61株对鹅胚的半数致死量(ELD50)为10。6·o／0．2mL，对雏鹅的半数致死量(LD50)为10。345／0．2mL。表明两株GPV毒株毒力、致病力没有明显差异。利用雏鹅制备的抗GPVSYG61株和P．1株的免疫血清，通过鹅胚中和试验测定了两株不同GPV株抗血清的PD50，并通过血清交叉保护试验对两株不同GPV株的抗原性进行鹿钟文：小鹅瘟病毒VP3基冈的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制II比较，经过计算

5、后得出两者抗原性相关系数R为85．41％，表明这两株GPV毒株之I、自J存在血清交叉反应，且抗原性交叉较大，属于同一血清型。应用Bac．to．Bac系统对GPV毒株SYG61VP3基因进行了表达。首先利用BamHI和XhoI双酶切将VP3基因片段从pGEM．T-VP3重组载体中切下，连接至杆状病毒转移载体pFastBacl中，获得重组转移质粒pFastBacl．VP3，并转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞，筛选出重组穿梭质粒rBacmid—VP3，转染Sf9昆虫细胞，获得了重组杆状病毒rBac—VP3。根据杆状病毒载体序列，经过PCR鉴定，证实基因片段VP3已经重

6、组到杆状病毒基因组中；用抗GPV多抗血清进行间接免疫荧光检测，结果出现亮绿色荧光，证明VP3基因获到了良好表达。2．抗GPV单克隆抗体的制备与鉴定本研究利用GPVSYG6、1作为抗原免疫BalB／c小鼠。免疫三次后取其脾细胞与SP2／0细胞进行融合，通过间接免疫荧光检测杂交瘤细胞上清，筛选获得了2株抗GPV的单克隆抗体，分别命名为GPV-Mab．2C5，GPV-Mab．4G9。亚类鉴定结果表明，2株单抗均为IgM亚类。2C5单抗腹水和细胞上清的IFA效价分别为1：3200和1：800，4G9单抗腹水和细胞上清的IFA效价分别为1：256和1：64。琼脂扩散试验证明2株单抗腹水都能与浓缩的

7、小鹅瘟抗原产生明显的沉淀线。并且均能与杆状病毒表达系统表达的GPVVP3蛋白反应，产生特异性的亮绿色荧光。本研究所获得的两株单抗为小鹅瘟抗原诊断方法的建立奠定了基础。关键词：鹅细小病毒；VP3基因；生物学特性；重组杆状病毒；单克隆抗体鹿钟文：小鹅瘟病毒VP3基冈的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制ExpressionofGoslingPlagueVirusVP3geneandDevelopmentofMonoclonalAnti