一种脂肪组织来源树突状细胞的鉴定及功能研究

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1、江苏大学硕士学位论文一种脂肪组织来源树突状细胞的鉴定及功能研究姓名：陈艳红申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：王胜军20120620江苏大学硕士学位论文摘要目的：在高脂饮食(hi曲一fatdiet，心D)诱导的肥胖小鼠脂肪组织中，发现一群未成熟的、具有分泌促炎症性细胞因子的树突状细胞，并研究这种脂肪组织来源树突状细胞(adiposetissuedendriticcells，ATDCs)的表型及生物学功能。方法：1．采用FITC抗小鼠CDllc单克隆抗体(mAb)对盯D和正常饮食(nomaldiet，ND)小鼠脂肪组织来源的细胞进行染色；

2、应用免疫磁珠法将ⅢD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CDllc+细胞进行分选，电镜观察其形态，并采用PE—Cy5抗小鼠CD3和B220mAb对细胞染色，通过流式细胞术(flowc”omet拶，FCM)进行分析。2．利用免疫磁珠分选方法将mD小鼠脂肪组织或脾脏组织来源的CDllc+细胞分选，同时分离ND小鼠腹腔巨噬细胞，将分离的三组细胞分别与表达红色荧光蛋白HcRed的大肠埃希菌(经3％多聚甲醛固定)37℃共培养2h，同时设立LPS刺激组，FCM分析各组细胞的吞噬能力。3．应用FITC抗小鼠CDllcmAb及PE抗小鼠CD40、CD80、CD86

3、、MHC．I、MHC．IImAb对HFD和ND小鼠脂肪组织细胞及脾脏组织细胞进行染色；FCM分析HFD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CDllc+细胞的表型。一种脂肪组织来源树突状细胞的鉴定及功能研究4．应用实时荧光定量PCR(Real．timequantitativePolymer懿eChainReaCtion，qI玎-PCR)的方法检测ⅢD小鼠ATDCs及脾脏来源DC(SPDCs)的几-6、TGF—p、IL．23p19、IL一12p40及几一12p35等细胞因子r曲NA的表达水平；酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedInullunos

4、orbentAssay，ELISA)检测ATDCs和SPDCs培养上清中IL一6及IL．23的蛋白表达水平口5．应用免疫磁珠分选方法将ⅫD和ND小鼠脂肪组织中的CD4+T细胞分离，将分离出的CD4+T细胞中加入离子霉素(ionomycin)和乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbolmyristateacetate，PMA)共培养4h，qRT—PCR检测IL一17及RO脚mRNA的表达水平。6．应用免疫磁珠法分别分选6—8w正常小鼠脾脏来源的CD4+T细胞、}玎?D小鼠ATDCs或SPDCs，将1×106的CD4+T细胞和2×105的ATDCs或SP

5、DCs共培养，同时设置抗小鼠IL．6mAb组、抗小鼠IL．23mAb组、抗小鼠IL．6mAb+抗小鼠IL．23mAb组及对照免疫球蛋白组；应用FITC抗小鼠CD4mAb及PE抗小鼠IL．17mAb对不同共培养体系中的细胞进行染色，FCM分析n17细胞的比例，ELISA检测培养上清中IL．17的蛋白水平。7．应用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，RT-PCR)方法检测ATDCs中趋化因子受体CCR6、CCR5及CXCl毪的表达，同时应用qlH．PCR的方法检测耶D及ND小鼠脂肪组织中相应趋化因子CCL20、MIP

6、．1及IL．8的表达水平。江苏大学硕士学位论文结果：1．FCM检测发现，与ND小鼠相比，耶D小鼠脂肪组织中CDllc+细胞的比例明显增高；脂肪组织中CDllc+细胞具有很长的突触，富含线粒体并且胞质中极少看到溶酶体；同时脂肪组织来源的CDllc+细胞均不表达CD3及B220分子；吞噬实验结果显示脂肪组织来源的CDllc+细胞的吞噬能力强于CDllC+SPDCs，但又低于腹腔巨噬细胞；而脂肪组织来源的CDllc+细胞的F4／80分子的表达与CDl1c+SPDCs相近，但低于腹腔巨噬细胞。上述结果提示心D小鼠脂肪组织中存在着一群形态典型的CDl

7、1c协Cs；与ND小鼠相比较，ⅢD小鼠脂肪组织中浸润的CDl1c+DCs细胞的比例明显增高。2．FCM结果显示ATDCs的表面分子MHCI及MHCII，共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达均低于SPDCs；LPS刺激后，ATDCs的MHC分子或共刺激分子的表达均未有明显变化，并且ATDCs吞噬功也未发生改变，表明脏D小鼠脂肪组织的ATDCs是一群未成熟的、表型稳定的DC。3．qRT—PCR检测显示，与SPDCs相比，ATDCs促炎症性细胞因子IL一6mRNA(8．103士1．067wl11．5士24．39，∥O．01)、TGF-pm

8、RNA(15．44士1．641w43．6l士5．417，p