外源性一氧化碳释放分子(corm)2对脓毒症中凝血系统血小板的(部分)调节作用及分子机制

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1、江苏大学硕士学位论文外源性一氧化碳释放分子（CORM）2对脓毒症中凝血系统血小板的（部分）调节作用及分子机制姓名：沈峻申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：孙炳伟201206江苏大学硕士学位论文摘要脓毒症(Sepsis)是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，即便在基础与临床医学研究及重症监护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下!分析表明，全世界10％的死亡患者与脓毒症密切相关。由于脓毒症的病理过程极其复杂，只有致力于阐明其确切的病理生理机制，寻找新的、有效的治疗靶点，才有希望逐步解决目前临床脓毒症防

2、治的重重困难。在脓毒症复杂的发病机制中，凝血系统紊乱是死亡率增加的一个重要原因。脓毒症是炎症反应和凝血活化的重要刺激因素，凝血活化和炎症反应之间存在明显的交叉反应。炎症通过诱导组织因子(TF)和血管内皮细胞表面白细胞黏附分子的表达，减少纤维蛋白溶解，抑制抗凝系统促进凝血；凝血酶又可刺激炎症反应发生。现在认为脓毒症早期以TNF．仅增高、凝血和纤溶激活为特征。脓毒症时产生的多种促炎症因子如TNF一0L、IL．1及IL一6等可引起并加重高凝。细胞因子增高后可见凝血酶生成的标志物和纤维蛋白原转变为纤维蛋白的标志物显著升高，提示凝血酶生成增加，凝血系统经细胞因子介导而活化。反之，凝血酶、因子

3、Xa、纤维蛋白等凝血因子又可通过刺激单核细胞、内皮细胞释放TNF．a、IL一1及IL．6等促进炎症反应发生。因此，凝血活化与细胞因子形成相互促进的循环，在研究脓毒症的病理生理及治疗时，必须高度重视凝血系统紊乱问题和抗凝策略。另外血小板活化、聚集形成病理性血栓，这在炎症和凝血之间复杂的相互作用中间也占据着非常重要的中间位置【1’21。内源性一氧化碳(carbonmonoxide，CO)是人体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生的重要的化学气体信使之一。大量的实验结果表明，CO在机体内发挥着重要的抗炎、细胞保护、抗凋亡等生理作用，并参与了脓毒症引起的氧化应激反应、内毒素性休克、缺血再

4、灌注损伤等病理生理过程。我们前期研究也发现CO可以有效地缓解急性炎症反应，表现出重要的抗炎效用和细胞保护作用，但其机制尚未完全明确。近年来，一氧化碳释放分子(tricarbonyldichlororutheniumIIdimer，CORM．2)是一种新合成的新型金属羰基化合物，被证实可以在机体内缓慢释放CO，具有外源性一氧化碳释放分子CORM-2对脓毒症中凝血系统血小板的(部分)调节作用及分子机制扩张主动脉、降低心肌缺血再灌注损伤等作用，有潜在的药用价值。而目前，有关外源性CO对脓毒症高凝状态的影响的相关研究还比较少见。本实验室已有研究表明，外源性CO在一定程度上抑制了脓毒症小鼠凝

5、血系统的活化。在脓毒症早期，可以通过拮抗血小板的异常活化和抗凝来进行治疗。为此，在本研究中，我们通过建立人静脉血CLP脓毒症模型，并用CORM．2进行干预，行离体实验研究。旨在探讨外源性CO是否对脓毒症早期高凝状态具有抑制作用，并探讨CO可能的作用机制。第一部分外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对体外人血小板膜糖蛋白及血小板功能的调节作用目的探讨CORM．2干预下人血小板膜糖蛋白及血小板功能指标的变化。方法以LPS孵育人静脉血，刺激血小板活化，再予以CORM．2干预。用流式细胞仪分析PRP中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p水平，以检测LPS刺激时血小板活化程度和CORM．2干预

6、结果；最后取抗凝血，用玻球法分析血小板粘附率，用血小板聚集仪分析血小板聚集功能的变化，并制出聚集率曲线图，从功能上分析CORM．2对血小板的作用。结果CORM．2可以降低LPS孵育后血浆中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p的表达，对活化后血小板粘附和聚集功能的亢进也有明显的抑制作用。结论从血小板活化及其功能指标的检测上显示了CORM．2可以在一定程度上抑制LPS刺激时凝血系统的活化，为脓毒症的治疗扩展了新思路。关键词：CORM．2，高氧，血小板，CLP,炎症反应第二部分外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对LPS刺激人血小板肌动蛋白聚合的影响目的探讨CORM．2干预下人血小板肌动蛋

7、白聚合的变化。方法取健康成人血小板以LPS诱导激活，分别用iCORM．2、不同剂量CORM．2处理，采用Triton抽提液提取后SDS．PAGE分离出肌动蛋白，经考马斯蓝R250染色、脱色，用凝胶成像仪照相，用分光光度计测定605nm的吸光值，II江苏大学硕士学位论文计算肌动蛋白的相对含量。．结果CORM．2可以抑制LPS孵育后血浆中血小板肌动蛋白的聚合作用。结论从凝胶成像仪照相，用分光光度计测定605rim的吸光值，计算肌动蛋白的相对含量显示CORM．2可以在一定程