ngf和cntf在先天性麻痹性斜视中的表达与其作用机制

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1、第一章材料与方法材料与方法1．1实验材料1．1．1实验样本收集2008年1月～10月在我院行斜视手术的先天性麻痹性斜视患者8例亢进下斜肌，麻痹上斜肌8例及同期无眼肌疾患行眼球摘除患者的上下斜肌各4例，均男女各半，年龄<3岁．取对应眼肌肌束，包括肌腱连接处。1．1．2免疫组织化学染色所需试剂兔抗人NGF—B多克隆抗体(bs-0067R)北京博奥森生物工程有限公司兔抗人CNTF多克隆抗体(SRP00338)天津塞尔生物工程有限公司SP染色试剂盒(SP-0023)北京博奥森生物工程有限公司DAB显色试剂盒(C—oolo)北京博奥森生物工程有限公司APES(AR0001)武汉博士德生物工程有限公

2、司1．1．3RT-PCR所需试剂及耗材Trizol(Invitrigenlifetechnologies公司)RT-PCR试剂盒(Promega公司)TaqDNA聚合酶(Promega公司)Tip头：101xl、200“1、1000p1(Axygen公司)1．5mlEp管(Axygen公司)200ulPCR反应管(Axygen公司)0．1％DEPC溴化乙锭(EB)(中国医学科学院血研所科技公司，Sigma分装)1×TAE溶液2％琼脂糖凝胶(西班牙琼脂糖)Marker(北京鼎国生物)Loadingbuffer缓冲液：6×溴酚兰1．1．4主要实验仪器及设备高温高压灭菌仪(Micromseri

3、esSA-300VA)--20℃冰箱(青岛澳柯玛公司)--70℃超低温冰箱(SN90549-318)2青岛大学硕士学位论文旋转切片机(Reichert—Jun9820)生物显微镜(NikonE600，Japan)，显微照相机(NikonDS一5M-LI，Japan)微波炉(顺德市格兰仕电器实业有限公司)石蜡切片机(德国)显微镜摄像机型，(日本)。BMJ一型包埋机及冷冻台(中国江苏)GNP一型隔水式恒温培养箱(中国上海)病理图文分析系统(中国武汉同济千屏影像工程公司)超低温离心机(SIGMA3K30，Germany)微量离心机(SIGMA卜13，Germany)振荡器(VORTEX—GEN

4、IC2)恒温箱(Thermohybaid／shake’n’stackHybridisationOven)高速匀浆器(Glas-ColGKH，USA)紫外线分光光度计电子秤(BP-3100s)制冰机(AFIO，Scotsman公司)超净工作台(JHT一000)微量加样器：29l、lOgl、401-11、200p1、1000pl(德国eppendorf公司)PCR仪(eppendorfMastercyclergradient，Germany)水平电泳槽(BIo-RADPowerPAC300)紫外线图象成像系统(VILBERLOURM，USA)数码相机(Canon，Japan)1．2．实验方法

5、1．2．1实验分组实验组：A组：先天性麻痹性患者的上斜肌8例B组：先天性麻痹性患者的下斜肌8例对照组：C组：同期无眼肌疾患的上斜肌4例D组：同期无眼肌疾患的上斜肌4例3第一章材料与方法1．2．2取材及标本的处理将4组分别分为三部分，一部分置于2．5％戊二醛中用于制作电镜标本；另一部分放入经过高压消毒并且DEPC处理过的EP管中，立即于-70℃深低温冰箱保存(手术操作过程中要避免核糖核酸酶和其他物质污染)。剩余部分置于10％中性福尔马林溶液中固定48h，常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋，5Bin连续切片，贴在涂有APES的清洁载玻片上，捞片，60"C烤片，过夜，用于HE及免疫组织化学染

6、色。1．2．3苏木素一伊红(HE)染色程序(1)石蜡切片入二甲苯I和二甲苯II中脱蜡各5rain；(2)无水酒精洗去二甲苯1min，两次；(3)95％、90％、85％、75％梯度酒精脱蜡，每步均1min：(4)自来水洗1min；(5)蒸馏水浸泡30sec；(6)1％苏木素中染色5min；(7)自来水充分冲洗；(8)1％稀盐酸酒精溶液分化脱色15see；(9)自来水充分冲洗；(10)1％氨水30see；(11)自来水冲洗1min；(12)0．5％伊红染色308eC；(13)95％酒精I、II脱水各1rain；(14)无水酒精I、II脱水各2min；(15)二甲苯I2min、二甲苯II5mi

7、n；(16)中性树胶封片；(17)显微镜下观察照相。1．2．4电镜标本的制作及观察(1)取材：新鲜眼肌组织块大约1mm3～2mm3(2)固定：2．5％戊二醛(磷酸缓冲液配制)固定1周，用0．1mol磷酸缓冲漂洗液15min×3次1％饿酸后固定2h，0．Imol磷酸缓冲漂洗液20min(3)脱水：50％乙醇：15min"-'20min70％乙醇：过夜90％乙醇：15min---20min90％乙醇：90％丙酮(1：1)15rain"-