感染根管内微生物检测方法探究进展

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1、感染根管内微生物检测方法探究进展【摘要】牙髓病和根尖周病是以厌氧菌感染为主的混合感染性疾病，根管持续的感染状态是根管治疗失败的最重要原因之一。近年关于感染根管的细菌群落组成及菌群中细菌之间关系的研究较多，而且应用了克隆文库、核酸杂交、16SrDNA指纹技术等多种分子生物学方法。本文将对近年来感染根管的分子生物学检测研究进展作一综述。【关键词】牙髓病；根尖周病；微生物检测；分子生物学【中图分类号】R781.3【文献标志码】A微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到了鉴定，能够在实验室培养的种类则更少，至多为1%

2、。传统的牙髓感染细菌厌氧分离培养影响因素多，鉴定困难。随着分子生物学技术的发展，更多的微生物在根管中检出。16SrD-NA指纹技术、克隆文库、核酸杂交等技术的应用使人们对牙髓根尖周病微生物组成的认识更加全面，对于进一步分析其协同作用等致病机制有所帮助。116SrDNA指纹技术指纹技术都是基于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)基础上的，其特异性的扩增产物代表着微生态系统中的微生物多样性。传统指纹技术有末端限制性长度多态性(terminal-restrie-tionfragmen

3、tlengthpolymorphism,T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelec-trophoresis,DGGE)和温度梯度凝胶电泳(tem-pe-raturegradientgelelectrophoresis,TGGE)o传统指纹技术主要根据扩增产物不同的解链特性，使相同相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离，已广泛应用于微生物生态系统研究。T-RFLP以PCR法为基础，扩增的是特定的标志基因(如16SrDNA),用荧光标志引物扩增产生的PCR产物携带荧

4、光标签。扩增产物来源于不同细菌，它们拥有不同的限制性核酸内切酶酶切位点，水解的PCR产物则产生不同的带形和指纹图谱。能检测到先前未鉴定或未能培养的细菌，但该技术比较费时费钱，重复性较差。2004年，Hommez等将T-RFLP法应用于感染根管细菌组成的研究中；但是没有强大的数据库支持，通用引物扩增存在偏嗜性，酶切后T-RFLP的长度分布也会低估复杂群落的多样性，这些问题使这种实验方法尚没有完全发挥其潜能。DGGE是在聚丙烯酰胺凝胶中加入线性梯度的DNA变性剂，在不同的变性剂浓度下，DNA分子解链的程度不同，当DN

5、A分子解链到电泳时产生的迁移阻力与电场力相平衡时，便停留在这一特定变性剂浓度的凝胶带中，从而使相同的相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离。Siqueira等应用DGGE方法比较了挪威及巴西慢性根尖周炎患者感染根管的细菌组成，分别检出了9.2和10.5个细菌条带，由此得出，感染细菌的组成在样本个体间差异明显，同一地区样本的细菌组成具有相似性。单纯比较条带数及条带位置只能推导出具有相关性的结论，要明确细菌组成则需要联合应用这些检测方法。Yang等用PCR-DGGE结合克隆测序方法研究了急性根尖周脓肿的细菌

6、组成后发现，检出频率由高到低的细菌依次是普雷沃菌、梭杆菌、消化链球菌、吓咻单胞菌、链球菌、真杆菌、乳酸杆菌、弯曲菌、螺旋体、布雷德菌。与培养法研究乳牙急性根尖周炎的根管优势菌为产黑色素普雷沃菌、微小消化链球菌的结果相似。对于难培养的牙密螺旋体和布雷德菌也有27.3%和36.4%的检出率，比以往文献的检出率大大提高，从而提示牙密螺旋体和布雷德菌可能是乳牙急性根尖周脓肿的致病菌。利用指纹技术研究菌群组成已被证实是可行的，通过比较指纹图谱可以了解不同个体或者不同生境的菌群组成差异。2实时荧光定量PCR技术及属、种特异性

7、PCR实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、无污染、具实时性和准确性等特点，定量PCR技术在牙周致病菌检测等方面已经应用多年。Saito等利用定量PCR技术检测了32例感染根管中牙龈13卜咻单胞菌和福赛斯坦纳菌，发现其检出率分别为28%和66%,两种菌同时出现的样本比例是22%,其范围分别为5.65X10-6〜1.20X10-2和5.76X10-6〜1.35X1

8、0-1；由此得出牙龈吓咻单胞菌和福赛斯坦纳菌与牙髓感染时的临床症状无明显相关性。Rocas等讨论了粪肠球菌的出现与不同类型根尖炎之间的关系,实验选择扩增特异性高的巢式PCR对样本16SrDNA片段进行扩增，在原发感染的50例患牙中粪肠球菌的检出为9例，阳性率为18%；而在30例无症状的已经进行根管充填但是伴有慢性根尖病损的患牙中粪肠球菌的检出率为20例，阳性率为66.7%