细胞凋亡检测方法探究进展

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1、细胞凋亡检测方法探究进展摘要：本文综述了细胞凋亡的各种检测方法的原理及应用范围，并分析了各自的优点及局限性。应选择适当的细胞凋亡检测方法进行综合检测，得到较为准确的结果。关键词：细胞凋亡；检测方法；分析评价细胞凋亡(apoptosis)是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡不受到外部损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程,即程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)[1]o它贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程，

2、近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着研究细胞凋亡的方法不断涌现和深入，分析手段日趋完善和成熟。现将细胞凋亡检测方法归纳如下。1形态学检测细胞凋亡是形态学名称，其特征性改变包括细胞浆固缩、体积缩小、细胞皱缩以及细胞核致密等。一般认为形态学变化是判断有无细胞凋亡的基础[2]。根据凋亡细胞固有形态特征，人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法，常用的有：普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜规察。普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体。但凋亡细胞的形态学变化大多

3、发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但细胞浆内的各种细胞器基本正常。凋亡细胞的典型形态改变在透射电镜下能够得到最佳的体现，为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。电镜检测细胞凋亡的缺点是：只能定性，不能定量;样本制作处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高［3-4］。2DNA片段化检测2.1DNA琼脂糖凝胶电泳检测法细胞凋亡时，DNA在内源性核酸内切酶的作用下•在核小体间被切割成180〜200bp

4、整数倍的单核昔酸片段。DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带；而当细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的”阶梯状”（ladder）条带；而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断，利用此特征，既可确定细胞的凋亡，又可与坏死细胞区别。因此DNA凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一［5］。这种检测方法简便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，灵敏性不高，但在作群体细胞凋亡分析时具有一定意义。本方法被广泛应用于作群体细胞凋亡分析中［6］。2.2EILSA法分析

5、组蛋白细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp〜200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。此法具有需要设备简单•敏感性高，所需细胞个数少等优点。其缺点是不能精确测定凋亡发生绝对量和提供细胞的组织学定位。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内，进而导致结果偏高，因此不同

6、的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件［7］。2.3DNA片段原位标记法2.3.1.原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术细胞发生凋亡时，核酸内切酶在DNA分子中导入切口，DNA多聚酶在切口部位表达外切酶活性，使核昔酸自5'向3'方向切去；同时以切口部位末端核昔酸的3'—0H为引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性将未标记的核昔酸用标记的核昔酸进行置换，切口沿DNA分子移动，同时水解5'末端，以修复DNA原位切口平移技术将标记的核昔酸引入凋亡细胞的DNA,据此可检测凋亡细胞。3流式细胞仪检测法流式

7、细胞仪（FCM）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于细胞定量分析和进行细胞分类研究的工具。此方法系通过荧光素如PKhoechst等亲DNA的特性，分析悬浮细胞中DNA含量的直方图来判断细胞凋亡。®PI染色法：凋亡细胞经PI染色、流式细胞仪检测，在正常细胞G1期的峰前增加1个特异性亚二倍体峰（sub-Gl峰）俗称”凋亡峰”。通过FCM测定DNA的含量还可以研究凋亡细胞的周期特异性。此方法的优点是可定量检测，灵敏度高。缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。②Hoechst-PI法

8、：此法可克服PI法的不足。hoechst被活细胞摄取后与DNA结合呈蓝色荧光；PI使坏死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可根据红蓝两种荧光判断3种细胞：正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红