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1、细胞凋亡检测方法新进展摘要 细胞凋亡是生命科学研究的热点之一,检测细胞凋亡的方法层出不穷。目前,用于体外细胞凋亡检测的方法已相对成熟, 比如: 流式细胞术、TUNEL检测法、DNA片断检测等。而用于体内细胞凋亡检测的试剂则正在研究之中, 各种检测试剂不断出现。其中,AnnexinV、Synap-totagminI-C2A、ApoSense家族分子与其他检测试剂相比具有一定的优势。该文在介绍几种常用的体外细胞凋亡检测方法的同时,重点介绍上述三种试剂。关键词 细胞凋亡;AnnexinV;synaptotagminI-C2A;ApoSense 1 引言细胞凋亡(apoptosi
2、s)又称程序性细胞死亡(pro-grammedcelldeath,PCD),是细胞在一定生理或病理条件下,按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控,是细胞为更好地适应生存环境而采取的主动死亡过程。细胞凋亡不仅在胚胎发生、器官发育及机体免疫等过程中至关重要,而且在心血管病变、神经性病变、肿瘤的发生等疾病中起重要作用。一些通过激活或抑制细胞凋亡来治疗疾病的方法不断出现, 如Caspases的激活剂或抑制剂、Bcl-2和survivin的反义RNA、重组的TRAIL等[2]。因此, 研究细胞凋亡对基础研究和临床应用有重要价值。体外细胞凋亡检测的方法已相对
3、成熟, 比较常用的方法是应用AnnexinV-FITC与PI双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡。体内细胞凋亡检测目前还处于成长期,但在临床应用上的价值则日益凸显[3]。本文在介绍细胞凋亡的形态和生化特征改变的基础上, 综述了常用的体外检测方法,并重点介绍体内凋亡检测方法中尚处于研究阶段的三类分子。 2 细胞凋亡的形态学和生化特征变化细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态学变化,首先是细胞变圆并与邻近细胞脱离,细胞质及胞浆浓缩,染色质固缩并聚集于核膜附近,DNA通常在核小体连接区被降解为180bp~200bp的整数倍片段,细胞膜突出形成质膜小泡,脱落后形成凋亡小体,其内可保留完整的细胞器和致密
4、染色质。由于凋亡小体被周围细胞吞噬,无细胞内容物外泄。因此,不同于坏死, 细胞凋亡过程中的形态学和生化变化可以很大程度地减轻对组织的损害[4]。最初人们仅从形态学特征的改变加以认识, 如细胞核皱缩、染色质凝集、细胞膜翻转、DNA片段化、线粒体肿胀和凋亡小体形成等。进一步的研究表明细胞凋亡涉及一系列复杂的生化反应, 是一个需要一系列酶参与的级联反应, 涉及不同基因的表达及调控、信号传导[2]。目前已知的凋亡通路包括线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。线粒体在凋亡过程中扮演重要角色,如Caspase激活因子的释放、电子传递链的变化、线粒体膜电位的去极化、细胞的氧化还原反应。线粒体膜上具有调
5、控凋亡的Bcl-2家族蛋白,该蛋白的结合状态将调节线粒体膜电位的变化, 改变细胞色素C(cytochromeC,CytC)等的释放,从而通过激活Caspase通路导致细胞凋亡,或直接作用于细胞核引起细胞凋亡。 3 细胞凋亡的体外检测3.1 形态学检测细胞凋亡与坏死的区别最早是通过电子显微镜(electronmicroscopy,EM)发现的。电镜可以观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化, 由于凋亡细胞在透射电镜下特征明显,所以EM是区别凋亡与坏死的黄金标准[5]。EM样品制作过程较复杂,设备仪器昂贵,因而没有广泛应用。细胞涂片或组织切片经hematoxylin和eosin(H&E)染色
6、后, 即可直接在光学显微镜(lightmicroscopy,LM)下观察。光镜下凋亡细胞体积缩小、细胞核固缩、染色体集中在核膜内侧,细胞膜皱缩并包裹细胞碎片形成“凋亡小体”。该方法简便易行,但分辨率低,不易检出早期的凋亡细胞。而且, 某些类型的细胞坏死与细胞凋亡形态相似,不易区分。该方法主观性较强,可用于凋亡检测的初步判断。光镜的精确性可以通过使用荧光得到提高,体外培养的细胞经荧光染料处理后,在荧光显微镜(fluorescencemicroscopy,FM)下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。这些方法只适用于体外培养的细胞的检测, 但在定量和定性方面较差,故在实际应用中很少被
7、单独使用。 3.2DNA片段化检测DNA被核酸酶剪切被认为是最显著的生化变化。凋亡细胞的DNA被核酸内切酶在核小体单位间断裂, 形成180bp~200bp或其整数倍的寡核苷酸片段, 用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带。而坏死细胞DNA则被降解成弥散条带。此方法简便易行,但梯状条带不能区分细胞凋亡与坏死。此外,DNA电泳法不能进行准确定量。 3.3TUNEL检测法TUNEL法最早由Gavrieli[6]于1992年引入。基本原理是: 由
