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《探析干预小鼠急性酒精性肝损伤细胞凋亡时间窗》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、探析干预小鼠急性酒精性肝损伤细胞凋亡时间窗DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.04.009作者单位:100050北京，首都医科大学北京友谊医院急诊科通信作者：杨立沛，Email：ylp8499@139.com【摘要】目的建立小鼠急性酒精性肝损伤的模型，通过测定肝脏组织内的相关增殖凋亡蛋白的变化，探讨抑制其细胞凋亡的治疗时间窗，以指导临床治疗肝损伤。方法将30只雄性KM种小鼠饲养于首都医科大学清洁级动物房，随机分为两组（随机数字法）。对照组10只给予正常喂养，实验组20只，
2、一次性给予50%乙醇（12mL/kg）灌胃，分别在灌胃6h（m6h）和12h（ml2h）两个时间点处死小鼠各10只。苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠肝脏组织病理学的变化。应用Western-blot的方法监测小鼠肝脏中蛋白T-ERK,P-ERK,PKC,P-PKC,caspase-3的含量变化。用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，进行方差分析，以P[Keywords]Mice；Acutealcoholicliverinjury；Apoptosis；Proliferation；T-ERK；P-ERK；PK
3、C；P-PKC；caspase-3在欧美国家中，酒精性肝病（alcoholicliverdisease,ALD）的患病率高达84%,其中20%〜30%的酒精性肝病可进展为肝硬化[1-2]o随着我国生活水平的提高，酒精消费量的日益增长，ALD的发病率也呈现逐年升高的趋势。目前，建立急性酒精性肝损伤的动物模型，并在动物模型上寻找干预急性酒精性肝损伤细胞凋亡的有效时间点，从而指导临床及时干预肝损伤，成为国内外研究的重点。1材料与方法1.1动物分组健康KM种雄性小鼠30只，体质量为18-22g,由首都医科大学实验动物部
4、提供，饲养于首都医科大学清洁级动物房，12h光照和黑夜循环，温度（22±2）°C,相对湿度50%〜60%,标准饲料，自由饮水。经过7d适应性喂养后，随机（随机数字法）分成2组，即对照组（10只）、实验组（20只）。实验地点是首都医科大学北京友谊医院中心实验室。1.2材料与试剂ERK(#5013),P-ERK(#4370),PKC(#2056),P-PKC(#9375),caspase-3(#9662)以及-actin(#4967)抗体均购自美国cellsignaltechnology公司，二抗购自中杉金桥。其他
5、为国产分析纯。1.3仪器ASP300自动脱水机(LEICA,德国)；EG1160自动包埋机（LEICA,德国）；RM2235石蜡切片机（LEICA,德国）；酶标仪（Biorad,美国）。1.4模型制备小鼠经适应性喂养后，禁食12h,实验组用体积分数为50%的乙醇（分析纯，以蒸馆水稀释）造成肝损伤模型，灌胃量12mL/kg,灌胃后禁食,灌胃后小鼠出现爬行不稳、腹拖地、闭眼懒动等醉酒指标[3],在实验过程中各组小鼠均无死亡。于灌胃后6h和12h处死动物，在小鼠肝脏固定部位取材，一部分置于福尔马林中，一部分迅速液氮保
6、存,用于形态学及分子生物学的研究。1.5实验方法1.5.1HE染色置入福尔马林中固定的小鼠肝脏组织,经脱水处理后包埋入石蜡，并切成4Um厚度的连续切片,黏附与载玻片上。经烤片，脱蜡，蒸憎水洗，苏木素染核,水洗，分化，伊红浸泡，水洗，脱水透明，中性树脂封片。镜下观察。1.5.2WesternBlot检测及其分析取肝组织匀浆，离心后取裂解液上清，BCA法蛋白定量测定蛋白浓度。取100trg蛋白于10%SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1h,—抗4°C孵育过夜，二抗室温孵育1h,ECL试剂
7、（pierce）检测阳性信号。以3-actin表达水平作为内参。1.5.3统计学方法计量资料以均数土标准差(x土s)表示，并用SPSS11.5统计软件进行方差分析，以P0.05；(1.30±0.25),(1.47±0.27),P>0.05］,而ml2h组中P-ERK含量与对照组比较差异具有统计学意义［F二4.82,(0.97±0.25),(2.41±0,38),P0.05；(0.10±0.01),(0.14±0・02),P>0.05］；而ml2h组中P-PKC的含量与对照组比较差异具有统计学意义［F二29.36
8、,(0.08±0.01),(0.16±0.00),P在本次试验中,经酒精灌胃12h后，肝小叶结构紊乱，肝细胞内脂肪空泡形成，具有活性的磷酸化ERK和磷酸化的PKC含量的较正常组小鼠显著降低,说明肝脏的抗凋亡效应降低，增殖缓慢；在同一时间点观察到反应细胞凋亡的Caspase-3蛋白显著升高，肝细胞处于凋亡状态。为什么这些变化发生在12h而不是6h呢？笔者认为一方面酒精经胃吸收发生作用有一
