成瘾性药物诱导的基因表达调控及其对药物奖赏行为的影响的研究

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1、复旦大学博士学位论文成瘾性药物诱导的基因表达调控及其对药物奖赏行为的影响的研究姓名：胡朝阳申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：马兰2012-05-08中文摘要药物成瘾是一种慢性、复发性脑疾病，表现为不计任何负面后果的、强制性的、无法自控的药物使用行为。越来越多的研究表明，长期滥用成瘾性药物导致奖赏相关脑区基因表达的异常，是成瘾行为形成及维持的重要的分子机制之一。因此，阐明基因表达的调控在药物成瘾行为中的作用及其机制尤为重要。微小RNA(miRNA)是一种短序列的非编码单链小分子RNA，被认为是参与基因转录后水

2、平调控的重要因子之一。它通过其2．8个碱基的种子区识别并结合到下游靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)，并招募Dicer和AGO等蛋白形成沉默复合物(对SC)，进而发挥抑制或降解靶基因mRNA的作用。近年来，很多体外以及体内的研究揭示了miRNA在神经系统中的重要功能。但是miRNA在药物成瘾中的作用及作用机制，尚不清楚。表观遗传学修饰是对基因转录进行调控的重要方式之一，主要是通过基因启动子区域染色体的重构来发挥调节基因转录的作用。一般来讲，基因启动子区域组蛋白H3或H4的乙酰化能激活基因的转录。近年来，人们逐

3、步发现了组蛋白乙酰化也在药物成瘾中发挥作用。但作为对基因转录水平调控的一种重要方式，组蛋白乙酰化如何参与对成瘾动机的调控尚未阐明。本研究采用大鼠条件位置偏爱模型(CPP，ConditionedPlacePreference)和自身给药模型(SA，Self-administration)研究了药物成瘾大鼠伏隔核中miRNA对海洛因奖赏行为的影响和组蛋白乙酰化在可卡因觅药动机中的作用机制，取得了以下主要研究结果：1．长期海洛因给药诱导的大鼠伏隔核miR-218下调及其对海洛因奖赏行为的调控长期海洛因给药调控伏隔核中多

4、种miRNA水平。在给予大鼠海洛因(1mg／l(g，一天2次，连续2周)后，我们采用real—timePCR的方法检测了伏隔核中76种miRNA的前体水平，发现与生理盐水对照组相比，miR．218，miR．221，miR．382，miR．383和miR-35l_前体的水平显著下调，而miR．21，miR-103，miR-20a和miR一298则显著上调。长期海洛因给药下调伏隔核中miR．218成熟体的水平。我们采用real．timePCR的方法检测了长期海洛因给药后miR．218成熟体水平，发现与miR．218前

5、体一样，其成熟体在伏隔核中也显著下调，而在海马中没有显著变化。另外，miR．218在前额叶皮层显示出明显下降趋势，但无统计学差异。伏隔核中miR-218对大鼠海洛因CPP和自给药行为的负性调控。为了研究伏隔核中miR一218对海洛因奖赏行为的影响，我们用慢病毒定位注射的方法干预伏隔核中内源miR一218的表达，然后检测其对海洛因CPP和自给药的影响。我们发现用重组慢病毒在大鼠伏隔核中过表达miR．218H⋯e显著降低海洛因诱导的CPP；相反，在伏隔核中用重组慢病毒表达抑匍JmiR．218活性的RNA片段能显著增加

6、海洛因CPP行为。同时，在伏隔核中过表达miR一218后，大鼠海洛因自身给药的踏板行为明显减少，而抑错qmiR一218后，大鼠的踏板行为明显增加。这些结果提示，伏隔核中miR．218能负性调节海洛因奖赏行为。伏隔核qbmiR-218水平改变不影响大鼠蔗糖自给药和八臂迷宫行为。为了检测伏隔核中miR．218水平变化是否影响自然奖赏和空间学习记忆，我们进行了蔗糖自给药和八臂迷宫实验。在蔗糖自给药实验中，注射了过表达或抑带lJmiR．218病毒的大鼠与对照大鼠相比，摄取蔗糖丸的数量没有差异。在八臂迷宫实验中，也没有观察

7、到注射过表达或是抑fl；lJmiR．218病毒的大鼠与对照大鼠在完成任务的时问上存在差异。2．筛选miR-218的下游靶基因筛选miR．218调控的基因。我们用Affymetrix大鼠基因芯片筛选了在原代培养的大鼠神经元中转染miR．218后转录水平发生变化的基因。结果显示，在29993个基因序列中，我们检测到了20020个基因在原代培养的神经元中有表达。与对照组相比，有1990个基因的mRNA水平下调，有753个基因的mRNA水平发生上调。应用DAVID软件进行分析，显示miR．218调节的mRNA中，有很多与

8、神经突触可塑性相关。采用Targetscan分析预测表明，在上述受miR-218调控的基因中MeCP2，DNMT3a(表观遗传学信号通路关键酶)，G，缎2，GABRB3(重要离子通道蛋白)和Sema6b，NRXNl(调控轴突导)是miR．218的可能靶基因。采用Real．timePCR的实验结果显示，在原代神经元中miR．218可以下调这些候选基因的mRNA水平。GluR