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1、红树林木果楝属植物可培养内生真菌多样性和其代谢产物抗肿瘤活性［摘要］从3种红树林木果楝属植物材料的枝、叶及果皮中经反复分离纯化获得24株真菌，采用rDNA-ITS序列分析技术对菌株进行了种属鉴定，结果表明它们分属于3纲9目11科14属；并发现不同种属、不同产地的木果楝属植物内生真菌在种群组成和数量上存在差异，其中拟茎点霉属Phomopsis＞炭疽病菌属Colletotrichum在3种植物材料中均分离得到。采用MTT法对菌液乙酸乙酯提取物进行体外抗肿瘤活性评价，发现15株真菌菌液乙酸乙酯提取物表现出良好的体外抗肿瘤活
2、性，值得进一步研究和开发。［关键词］木果楝属；内生真菌；分离鉴定；抗肿瘤活性植物内生真菌(endophyticfungi)是指其生活史的某一段时期生活在植物组织内、对植物组织没有引起明显病害症状的真菌［1］。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，与宿主协同进化，可能有与宿主相同的次级代谢途径［2］；另外，真菌往往具有易培养、易控制、易通过现代生物技术改造遗传性状等特点，因此内生真菌是活性天然产物的重要来源。目前关于传统药用植物以及特殊生境中植物内生真菌的研究日益增多，获得了许多结构新颖的活性化合物,进展较快［3-5
3、］„红树植物(mangroveplants)是一类较为特殊的木本植物群落，生长在热带、亚热带海岸潮间带，受海水周期性浸淹，生长环境独特。红树林生态系统开放性强，生物种类繁多，不仅在自然生态平衡中起着特殊作用，而且具有抗菌、抗肿瘤等药用价值［6］。近年来，对此类植物内生真菌的种类、次级代谢产物类型的多样性及其抗菌抗肿瘤活性等研究日益增多［7］。楝科木果楝属Xylocarpus植物是红树林的组成树种，常混生于红树林中，世界范围内木果楝属植物仅有X.granatum,X.moluccensis,X.rumphii3无申，分
4、布于非洲、亚洲及大洋洲北部的热带海岸，我国境内只有X.granatum(木果楝)1种，分布于海南沿海［8］。长期以来，印度人一直使用木果楝来治疗疟疾等一些发热性疾病，一些东南亚国家也将其用来治疗腹泻、霍乱和疟疾等发热性疾病。目前，对木果楝的研究主要集中在化学成分方面，其特征性成分柠檬苦素类化合物具有抗肿瘤、抑制HIV、抑菌、杀虫等良好的生物活性［9-11］o然而，有关木果楝属植物内生真菌的研究未见报道。本研究以采自海南三亚和泰国南部的董里府(Trangprovince)海岸的木果楝属植物的枝、叶、果皮为材料，研究其内
5、生真菌的种属多样性及其次级代谢产物的抗肿瘤活性，一方面为研究木果楝植物与其内生真菌之间的关系奠定基础，另一方面，旨在获得有良好药理活性的菌株，以寻找具有新颖结构的生物活性先导化合物，用于创新药物研究。1材料1.1植物木果楝X.granatum枝、叶、果皮分别于2011年11月采自海南三亚，2012年8月采自泰国南部的董里府海岸；X.moluccensis于2012年8月采自泰国南部的董里府海岸，采集和鉴定工作由暨南大学药学院吴军教授完成。采集后的材料放于保鲜袋并于冰盒中保存，3d内进行内生真菌的分离。1.2内生真菌培
6、养基PDA培养基（马铃薯葡萄糖培养基）：马铃薯200g去皮切块煮沸30min,纱布过滤，MgS040.75g,KH2PO43.0g,葡萄糖20g,水1L,pH5.8,121°C灭菌15mino分离培养基另添加琼脂1.2%、氨节青霉素和链霉素（无菌过滤加入，各100mg-L-1）用于抑制细菌生1.3药品与试剂真菌DNA提取缓冲液：100mLTris-HCl（pH8.5）,25mL0.5mol•L-1EDTA（pH8.0）,25mL10%SDS,7.3gNaCl,加水定容至500mLo克隆载体pEASY-Tl、大肠杆菌感
7、受态细胞Transl-Tl购于北京Transgen生物技术有限公司；TaqDNApolymerase,10XPCRbuffer,dNTPsMix及MgC12购于Invitrogen生物技术公司；引物ITS1F,ITS4合成及测序工作送交Invitrogen生物技术公司完成。1.4仪器PCR仪（美国Bio-Rad公司），电泳仪（北京六一厂），ELX800全自动酶标仪（美国Biotek公司）。2方法1.1内生真菌的分离、纯化分别取3种材料的茎段、树叶、果皮，按以下程序严格进行表面消毒：采集的材料在流水下冲洗干净，无菌条件
8、下，用75%乙醇浸泡3〜5min,无菌水冲洗5次，0.1%升汞浸泡10〜15min,无菌水冲洗5次，用无菌滤纸片吸干水分。将叶片、果皮去除边缘，切成1cmX1cm的小块，茎段去除两端，先纵切为4部分，再切成2cm长片段，处理好后的材料接种于装有内生真菌分离培养基的平皿上，28°C倒置暗培养3〜15d,每日定时观察真菌生长情况，将新长出的菌丝挑取
