褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抵制作用及机制研究

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1、青岛大学博士学位论文褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抵制作用及机制研究姓名：薛美兰申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：葛银林20120529褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抑制作用及机制研究摘要背景与目的：褐藻糖胶(fucoidan)是从海带中提取纯化的一种多糖，其主要组成为褐藻糖、硫酸根，以及少量糖醛酸、半乳糖、木糖。褐藻糖胶具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、增强免疫力等生物学功能，使之成为天然海洋药物研究的热点。研究证实，褐藻糖胶对肠癌、乳腺癌、肝癌和白血病等均有明显的抑制作用，并能诱导细胞凋亡，而对正常细胞无毒副作用，但对其具体的作用机制尚未阐明。本研究以小鼠乳腺癌细

2、胞4T1为靶细胞，采用体外培养细胞(体外实验)及建立荷瘤小鼠模型(体内实验)方法从分子水平、细胞水平及动物整体水平探讨褐藻糖胶的抗肿瘤活性及其作用机制，为最终将该药开发成为一种新型的天然抗癌药物奠定基础。方法：1．体外实验：体外培养小鼠乳腺癌细胞4T1，采用MTT比色法、荧光染色、流式细胞术(flowcytometry,FCM)、RT-PCR、．Westernblotting等方法，观察不同浓度褐藻糖胶对4T1细胞增殖和凋亡的影响，探讨褐藻糖胶体外的抗肿瘤活性及其作用机制。2．体内实验：培养4T1细胞接种Balb／e小鼠建立荷瘤小鼠模型，观察褐藻糖胶对荷瘤小鼠移植瘤生长的抑制情况，T

3、UNEL染色检测瘤组织凋亡细胞，Westernblot及免疫组化等方法检测褐藻糖胶处理后瘤组织内Bel．2／Bax、生存素(Survivin)、B连环蛋白(B．eatinin)、细胞周期蛋白Cyclin．D1和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK4以及血管内皮生长因子(VEGF)等相关蛋白的表达，探讨褐藻糖胶体内的抗肿瘤活性及其作用机制。结果：1．体外实验：褐藻糖胶(O、50、100、200I．tg／m1)作用4T1细胞48h后，在荧光显微镜下观察到褐藻糖胶处理组细胞出现典型的凋亡形态学改变：细胞核固缩、有DNA碎片；RT．PCI汲Westernblot结果显示，随褐藻糖胶浓度的增加，B

4、el．2mRNA和蛋白表达均下降、BaxmRNA和蛋白表达升高，导致Bcl．2／Bax比值下降；凋亡抑制蛋白Survivin表达增加；线粒体膜电位下降，细胞色素C由线粒体向细胞浆释放增加，Caspase-3的活化率逐渐增加，明显高于对照组(尸<0．05)：MTT比色结果显示褐藻糖胶能抑带JJ4T1细胞增殖；细胞周期分析表明，经50、100、200I_tg／ml褐藻糖胶处理48h后，G1期4T1细胞数明显增加，呈明显的G1期阻滞；Westernblot结果显示随褐藻糖胶浓度增加，B-catinin、CyclinDl和细胞周期依赖激酶CDK4表达逐渐减少(P<0．05)。另外，褐藻糖胶处

5、理后，VEGF表达也出现减少(尸

6、nt通路中B．c撕nin、CyclinDl、CD瞄的表达和抑帛IJVEGF的生成有关。博士研究生薛美兰(病原生物学)皇指导教师葛银林教授关键词：褐藻糖胶；细胞凋亡；细胞周期阻滞；乳腺癌；荷瘤小鼠AntitumorEffectsofFucoidanandtheRelatedMechanisminVitroandinVivoAbstractBACKGRoUND&OBJECTIVE：Fucoidanisasulfatedpolysaccharidederivedfrombrownalgaethathasbeenreportedtoperformmultiplebiologicalactiv

7、ities，includingantitumoractivity．Fueoidancouldinhibitthegrowthoftumors，butthemechanismremainsunclear．Tllisstudyaimedtoexploretheantitumoreffectsandtherelatedmechanismoffucoidaninvitroandinvivowimmousebreastcancel．eellline4T1astarg