纳米金标记—逐步银染法快速检测金黄色葡萄球菌

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1、分类号』!!uDc鹾密级——编号——十南大学CENTRALSoUTHUNIVERSITY硕士学位论文论文题目：-一纳苤全拯运：逐生堡鎏洼：迭造捡测金黄鱼萱莹壁菌学科、专业：!晦废医堂研究生姓名：塞』型!兰指导教师：俭直煎塾援中南大学二零一二年五月一苓一一，平丑月分类号VDC硕士学位论文纳米金标记一逐步银染法快速检测金黄色葡萄球菌NanogoldlabeHng—stepwisesilverstainingmethodforrapiddetectionof脚，lJ勘cDcczfs口z"℃跖s作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：刘小兰临床

2、医学医学检验系徐克前教授论文答辩日期：塑!兰：曼：丝答辩委员会主席中南大学二零一二年五月一夸一一，平丑月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：勤生兰日期：丝!兰年旦月丛日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家

3、或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：囝期：丝年三月坐日中南大学硕士学位论文中文摘要摘要目的：建立一种可以在微孔板上快速检测金黄色葡萄球菌的纳米金标记一逐步银染法，并将该方法应用于多种临床标本的快速检测。方法：采用HEPES还原法制备纳米金，并使其与巯基修饰的寡核苷酸探针偶联从而制备纳米金探针。以金黄色葡萄球菌特异的nuc基

4、因为靶序列，利用己包被链霉亲和素的微孔板，将PCR扩增的nuc基因与生物素探针、纳米金探针形成的三明治杂交结构锚定其上，加入银染液于低温下逐步银染显色，通过酶标仪检测放大的银染信号。评价该方法的灵敏度、特异性及重复性。对51例临床标本进行检测，并将检测结果与PCR法、培养生化鉴定法进行比较。结果：制备出平均粒径为12nm，且高度分散的纳米金溶液。标记了巯基探针的纳米金的最大吸收峰发生了5nm红移。通过一系列优化实验建立微孔板上纳米金标记一逐步银染检测体系：逐步银染的条件为4℃银染，5min×4次；杂交体系中生物素探针的最适浓度为loonmOl

5、／L；纳米金探针最适浓度为20nmol／L。该方法可以在显著降低非特异性背景信号的同时放大银染信号，检测金黄色葡萄球菌nuc基因的灵敏度为1pmol／L，比常温一步银染法的灵敏度提高约102倍。与所试验的其他菌株均无非特异性扩增与杂交。600pm01／L和6nmol／L靶序列的批内、批间变异系数均小于10％。51例临床标本的检测结果与PCR法一致，与培养生化鉴定法的检测结果之间无显著性差异(尸>0．05)。T中南大学硕士学位论文中文摘要结论：本研究成功构建了金黄色葡萄球菌的纳米金标记一逐步银染法。该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性强等优点，

6、不需要特殊仪器仅在酶标仪上即可完成结果的检测，在病原微生物的快速检测领域表现出广阔的发展潜力。关键词既PES，纳米金，生物素．链霉亲和素，逐步银染，金黄色葡萄球菌中南大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTObjec晰e：TodeVelopanano901dlabeling—st印wisesilVerstainingmethodonmicroplateforrapiddetectionof&哪破y肠cDcc淞口靴淞，and印plythemetllodtorapiddetectionofVariousclinicalspeclmens·Meth

7、od：Goldnanoparticlesaresynthesizedbyusing}玎三PESasareductant．Thennanogold-1abeledprobesarepreparedbymesep砒iclescoupledwimsulmydUlmodifiedoligonucleotideprobes．ThemethodinVolVesfomingthesandwichstmct吡esbythehybridizationofPCRanlplificationproductsof&印砂肠cDcc螂口甜理郴specificnucgen

8、ewithbiotin—labeledprobesandnanogold-labeledprobes．When廿1esandwichstmctLlreswerean