禽用免疫磁珠纳米疫苗的制备及初步应用研究

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1、华中农业大学硕士学位论文禽用免疫磁珠纳米疫苗的制备及初步应用研究姓名：石笑添申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：毕丁仁201206禽用免疫磁珠纳米疫苗的制备及初步应用研究摘要免疫磁珠(ImmunomagneticBeads，IMB)是表面包被有抗体(或配体)的磁性微球。能特异性吸附抗原(受体)等物质，目前已广泛应用于生物和医学等领域。本研究利用化学共沉淀法合成磁珠，再将抗GST标签蛋白偶联到改性后的磁珠表面，免疫试验动物制备大量鸡抗GST多克隆抗体，与此同时验证其免疫佐剂效应。将GST多抗包被磁珠，制备得到IMB．

2、GSTAb，然后用IMB．GSTAb捕获GST-VP2(禽法氏囊病毒VP2抗原)、GST-HN(禽新城疫HN抗原)融合蛋白，用于免疫实验动物鸡，探索新基因工程纳米疫苗免疫增强作用和免疫保护力。动物实验证明IMB具有一定的免疫增强作用和良好的生物安全性。本研究为寻找一种操作简便、安全有效且价格低廉的新型纳米佐剂提供了参考，同时也为禽主要疾病的疫苗生产及防控提供了新的思路。1．鸡抗GST多克隆抗体的制备培养含GST表达载体(pGEX．KG)的大肠杆菌BL21，收获GST蛋白。过Sepharose4B柱子纯化得到的GST蛋白，包

3、被于自制磁珠的表面，免疫2周龄艾维因鸡，ELISA检测血清效价达1．6×104，证明自制磁珠具有免疫增强作用。采血得到鸡血清，按辛酸．硫酸铵法提纯鸡抗GST多克隆抗体。Westernblot试验证明自制GST多抗具有生物学活性和特异性。2．IMB—GSTAb的制备采用化学共沉淀法合成Fe304纳米粒子，并对其表面进行修饰，使其表面带有．CHO基团，得到平均粒径在50．100nnl之间并具有超顺磁性的磁珠，改性后磁珠的浓度为5．5mg／mL。将磁珠与GST抗体偶联制备IMB—GSTAb，用IMB．GSTAb捕获GST-VP2

4、、GST-HN融合蛋白。通过控制和改变缓冲介质、溶液pH值、反应时间和温度等参数，优化磁珠偶联抗体的条件。通过用紫外分光光度计测定反应前后溶液中蛋白浓度，对磁珠偶联抗体的效果进行评价，确定偶联抗体的最佳条件为O．1MTBS(pH6．0)缓冲液，37。C混匀仪中孵育3h；捕获极值为45—501xg／mg；封闭IMB的最佳条件为5％脱脂奶粉，37。C混匀仪中封闭2h；IMB．GSTAb捕获GST-VP2融合蛋白的最佳反应条件为O．01MPBS(pH7．4)缓冲液，37。C混匀仪中孵育1h，捕获极值为15pg／mg；IMB．GS

5、TAb捕获GST-HN融合蛋白的最佳反应条件为O．01MPBS(Ph6．8)缓冲液，华中农业大学2012届硕士学位论文37。C混匀仪中孵育1h，捕获极值为1299／mg。3．禽用磁珠纳米疫苗的应用用捕获GST-VP2(B组)和GST-HN(E组)的IMB免疫1周龄鸡，同时设对照组，分别为GST-VP2组(A组)、GST-HN组(D组)、法氏囊病毒灭活苗组(C组)、新城疫病毒灭活苗组(F组)和PBS组(G组)，每组5只，于四免疫后翼下静脉采血，ELISA方法测定血清中抗体水平，结果显示，B组与A组存在极显著差异，与C组无显著

6、差异；E组与D组抗体效价水平存在显著差异，与F组无显著差异。证明白制的磁珠纳米疫苗具有一定的免疫效果。关键词：免疫磁珠IMB；GST标签蛋白；纳米佐剂；GST-VP2；GST-HNII禽用免疫磁珠纳米疫苗的制备及初步应用研究AbstractImmunomagneticBeads(IMB)weremagneticmicrospherescoatedwithantibodyorligandwhichcouldabsorbantigenorreceptorspecifically．IMBhasbeenwidelyusedinbi

7、ologicalandmedicalfield．Inthisstudy,magneticbeadswerepreparedbythechemicalCO-precipitationmethod．ThenthebeadswerecoatedwimGSTantibody．SowegotIMB—GSTAbbeadswhichwereabletocaptureGST-VP2andGST-HNfusionprotein．TheIMB—GSTAbbeadsbindingGST-VP2andGST-HNwereusedforchicke

8、nimmunizationtestSOthatthebiologicalsafetyandimmunologicalenhancementofIMB-GSTAbcouldbeassayed．AnimalexperimentsshowthattheIMBhasacertaindegreeofimmunee