磷酸肌醇3-激酶信号通路参与肺损伤修复及机制探讨

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1、复旦大学博士学位论文磷酸肌醇3--激酶信号通路参与肺损伤修复及机制探讨姓名：方晓聪申请学位级别：博士专业：临床医学八年制指导教师：王向东2012-04-06博士学位论文中文摘要中文摘要第一部分P13K抑制剂对急性肺损伤的保护作用及机制目的：探讨磷酸肌醇3．激酶(Phosphatidylinositol3-kinases，P13K)抑制剂对肉毒素脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)所致小鼠急性肺损伤的保护作用，并比较不同的给药方式、给药剂量、药物种类以及不同时间点的疗效差别。方法：取6—8周龄的雄性CD一1小鼠，连续3天分别经鼻(O．5mg／kg)或

2、经胃管(50mg／kg)滴入3种不同的P13K抑制剂(LY294002，SHBM009，GDC0941)或PBS，随后经气道滴入LPS(1．25mg／kg)诱导肺损伤，分别在LPS滴入后4h和24h处死小鼠(每组每个时间点10只)。观察这3种P13K抑制剂对LPS刺激后小鼠肺毛细血管通透性、肺组织重量／体重比值、肺组织气体容量(excisedlunggasvolume，ELGV)、肺泡灌洗液蛋白渗出和炎症细胞浸润、肺泡灌洗液(Brochoalveolarlavagefluid，BALF)炎症因子水平的影响，并比较不同给药方式、不同时间点的疗效差别。A549上皮细胞分

3、别在含有不同浓度SHBMl009(1或10ug／mL)的培养基中培养，然后用LPS(1ug／m1)或PBS刺激。在刺激后3,6，12，24收集培养液上清，4"C离心10000rpm10rain，用ELISA方法测定培养液上清中角质细胞源性趋化因子(KC)、白三烯B4(LTB4)的水平。结果：LPS刺激后4h和24h小鼠肺组织重量／体重的比值明显高于PBS刺激组(P<0．01)，经鼻或经胃管滴入LY294002或GDC一0941能抑制肺组织重量／体重比值的升高(P<0．05)，具有保护作用。经鼻滴入SHBMl009亦具有明显保护作用(P<0．01)。经鼻滴入LY294

4、002或SHBMl009能明显抑制LPS刺激4h或24h后ELGV的增加(P<0．05)。经鼻滴入这3种P13K抑制剂均能抑制LPS刺激后4h肺泡灌洗液的白细胞浸润(P<0．01或O．05)。LPS刺激能明显增加4h和24h小鼠肺泡灌洗液角质细胞趋化因子(KC)的含量(P<0．01)，只有SHBMl009经鼻滴入4h组显示出明显抑制作用(P<0．01)。利用伊文思蓝染色证明LPS能增加肺泡毛细血管通透性(P<0．01)，而经鼻滴入SHBMl009具有明显保护作用(P<0．05)。通过肺组织免疫荧光染色方法发现经鼻滴入SHBMl009能抑制LPS所诱导的中性粒细胞(P

5、<0．01)和巨噬细胞的浸润(P<0．05)。经LPS刺激的气道上皮细胞培养液上清中KC的水平在3-24h均有明显升高，而SHBMl009(1ug／ml和10ug／m1)能显著抑制上皮细胞分泌KC，且呈剂量依赖性(P值分别为P<0．05和P<0．01)。LPS刺激后24h，上清液中LTB4和LTB4的水平也有明显升高。结论：P13K抑制剂能预防LPS所导致的小鼠急性肺损伤，主要通过保护毛博士学位论文中文摘要细血管内皮屏障、抑制上皮细胞活化、抑制炎症细胞浸润和黏附能力、减少炎症因子释放等。局部给药的保护作用优于全身给药，且不同P13K抑制剂的保护作用也有差异，这可能和

6、药物的化学结构、靶向部位以及药动学特点有关。关键词：磷酸肌醇3．激酶，急性肺损伤，内毒素脂多糖中图分类号：R5634博士学位论文中文摘要第二部分P13K抑制剂对慢性气道炎症、组织损伤和气道重塑的治疗作用目的：探讨P13K抑制剂对胰弹性蛋白酶(pancreaticelastase，PE)所诱导的大鼠慢性气道炎症、组织损伤和气道重塑的治疗作用。方法：取180—2009的健康雄性Wistar大鼠，气道滴入PE4250IU&g)诱导肺损伤模型，在随后的7天或28天内经鼻滴入PBS、SHBMl009或布地奈德(budesonide，Bud)观察其治疗作用。实验共分为6组：1)

7、Sham组：PBS刺激+PBS治疗；2)Vehicle组：PE刺激+PBS治疗；3)SHBMl009对照组：PBS刺激+SHBMl009(10mg／kg)；4)SHBMl009低剂量组：PE刺激+SHBMl009(1mg／kg)：5)SHBMl009高剂量组：PE刺激+SHBMl009(10mg／kg)；6)Bud组：PE刺激+Bud(10mg／kg)。每组每个时间点6只大鼠。通过HE染色、电镜、Masson染色观察大鼠肺组织病理变化，同时测定大鼠ELGV、肺组织密度、肺组织重量／体重、BALF蛋白含量和细胞计数，ELISA方法检测肺泡灌洗液炎症因子IL一1p水