《电转化方案》word版

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1、一、酵母菌电转化方案:方案一。1、负80度取出涂平板。30度培养二天。2、取平板单菌落接种到10mlYPD培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。4、用20mlTE/LioAC(0.1M/0.1MpH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟5、加0。5ml1MDTT再摇15分钟6、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用20ml冰冷的1M的山梨醇重悬第三次沉淀用1ml冰冷的1M的山梨醇重悬8、每40ul一个转化体

2、系分装9、转化条件1。5KV20uF200Ω40ulyeast/reaction100ngDNA/reaction<5ul10、加150ul1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。方案二、1、负80度取出涂平板。30度培养二天。2、取平板单菌落接种到10mlYPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。4、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬第二次沉淀用20ml冰冷的1M的山梨醇重悬

3、第三次沉淀用1ml冰冷的1M的山梨醇重悬6、每40ul一个转化体系分装7、转化条件1。5KV20uF200Ω40ulyeast/reaction100ngDNA/reaction<5ul8、加1000ul1M山梨醇快速混合酵母和DNA，9、30度温浴1~2小时，不能摇动。然后涂在选择培养基上。二、怎么样选择电转仪（电转仪的功能与适用对象）美国著名BTX是专业的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。自从1983年起，苛求的科研工作者就已经把BTX产品作为电融合、转基因等应用领域的首选仪器。除了占世界领导地位的电融合、转基因系统外

4、，BTX的产品还包括多达25种相关的配件，其中有多种专业的电极，给用户更多的选择。BTX还在网站建立了技术数据库，提供超过5000份的参考目录和600多份的protocols供科研工作者免费查阅。1、ECM399转基因仪主要用于哺乳动物转染、细菌酶转化，具有脉冲长、磁场强为其特点。应用举例高压型用于：DNA或诱变等大肠杆菌结构转基因低压型用于转染、淋巴、髓胶质成纤维和COS-7细胞无论任何一种哺乳动物细胞均可选择不同的电压和脉冲范围，并且脉冲可随时调整•细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）电穿孔现在被认作是转化

5、细菌及酵母的最有效的方法。革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliobacterpylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。Planelles等人（1999）使用电穿孔转化大肠杆菌，以避免使用包装物质。最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化（例如脉冲长度产

6、生方面扩展的功能条件）。RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁，因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。Faber等人（1994）年优化了S.Cerevisiae的实验方案，使用HansenulaPolymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。在质粒修复中，质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析，这是另外一种重要的技术。这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化，用于验证隐性基因的结构，将其导入酵母，看基因性和表现性之间的关系。已

7、经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTXECM630转化细菌/酵母。使用方形波电穿孔仪的实验方案，例如BTXECM830，来转化细菌/酵母。研究人员还成功将大的质粒（BAC及YAC）导入细菌。电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件，而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。2、ECM630型是多才多艺型细胞转基因仪，适应于各类细胞应用举例：10-500V电压：适用于哺乳动物细胞，植物细胞50-2500V电压：适用于细菌、酵母各种型号，均有多种脉冲选择•细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）电穿孔

8、现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliob