分枝杆菌电转化方案

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1、分枝杆菌电转化分为慢速生长型分枝杆菌(如TiceBCG/M.M/H37Ra/H37Rv菌等)及快速生长型分枝杆菌(如M.smegmatice菌等)。Scheme：慢速生长型分枝杆菌电转程序：[注意：也可以采用菌落转化：取新鲜的菌落，约两满板，刮到含有玻璃珠的50ml离心管，要充分打碎，打散！剧烈震荡至少5X5min。然后用10%甘油洗涤3遍，其余同下面的转化。]1.需要准备的材料：1)10%甘油+0.05%Tween80[20ml甘油+180毫升水+100ulTween80，并用0.2µm滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周]2)灭

2、菌的玻璃珠，50ml离心管，Bio-rad于0.2cm的电转杯，25-ml移液管。3)50ml长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到0.5-1.0]。带滤芯的1ml枪尖。2.程序：1)将待转菌接种至含有50mL7H9(含0.1%tween80)的液体培养基的锥形瓶中，37度摇菌扩增（对M.marinum，M.ulcerans是28-30度）。[冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml离心管复壮，待长起之后，需取>2ml，接种到含含有50mL7H9(含0.1%tween80)的液体培养基的锥形瓶中；菌落需取很多加入含有50mL7

3、H9(含0.1%tween80)的液体5培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；普通生长的或在4度保存的菌，接种时可以取5至10ml加入含有50mL7H9(含0.1%tween80)的液体培养基的锥形瓶中。]1)检测菌液的OD值，若达到0.5-1.2，则可进行电转化。2)配制10%甘油+0.05%Tween80并用0.2µm滤器过滤。3)将40ml菌液转至50mL离心管中，加入10~13颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后[目的是将菌团块打散]，于离心机中4000-8000rpm离心5分钟。弃上清[千万小心，菌块很

4、容易脱落]。4)加入40mL10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于离心机中以4000-8000rpm离心5分钟，弃上清[千万小心，菌块很容易脱落]。5)重复步骤5）1-2次后，留约1mL上清[视菌浓度而定，一般较稠，似大肠杆菌感受态细胞密度]，用带滤芯的枪尖，吹吸均匀后，室温静置。[千万注意：枪杆不要碰到管壁。]6)于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10µL浓缩后的质粒DNA和200µL分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸混匀后，于37度孵育至少10分钟，以利DNA吸附于细菌。7)用Bio-radGenePulser点转移，以电压2

5、.5KV、电阻1000Ω、电容25µF脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于19~21秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸，不过很多情况下，爆炸后的也可以长出阳性克隆。未发生爆炸的电转杯灭菌后仍然可用。8)迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2mL7H9(含吐温80)培养基(先用1mL转移电转液，再用1mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中。[千万注意：枪杆不要碰到管壁。]9)于37度孵箱中孵育12~20小时，充分复活细菌并使其抗性表达。10)用带滤芯的枪尖吹吸混

6、匀后，1ml/1.5mltube分装，10000rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6mL7H9培养基重悬后，以500µL/板铺于7H11(含4-anti*及相应抗生素)培养板中。同时稀释一百倍后，500µL/板铺板。[可以尝试制备的感受态于-80保存，过几周后进行转化实验]11)避光，于37度孵箱培养5[培养时，2个平板放在一个塑料袋中。避免多个放在一起，造成连环污染]。1)每周观察污染情况，第一周后，平板倒置。观察时，不要打开塑料袋。第4周可以判断转化是否成功。注意：离心要配平。备注1:4-anti抗生素:多粘菌素B、放线

7、菌酮、羧苄西林及甲氧苄啶，终浓度分别为200、50、50及20µg/mL)。培养BCG，H37RvandH37Ra的7H9可以加:4-anti抗生素。快速生长型电转程序：51.需要准备的材料：1)10%甘油+0.05%Tween80[20ml甘油+180毫升水+100ulTween80，并用0.2µm滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周]2)灭菌的玻璃珠，50ml离心管，Bio-rad于0.2cm的电转杯，25-ml移液管。3)50ml长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到0.6-1.3]。带滤芯的1ml枪尖。2.程序：1)将待转菌

8、接种至含有50mL7H9(含0.1%tween80)的液体培养基的锥形瓶中，37度摇菌扩增。[冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml离心管复壮，待长起之后，需取>2ml，接种到含有50mL7H9(含0.1%tween80)的液