具有肿瘤杀伤活性粒细胞的筛选及其体外抑瘤效应研究

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1、第三军医大学硕士学位论文具有肿瘤杀伤活性粒细胞的筛选及其体外抑瘤效应研究姓名：郭慧军申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：赵树铭201205第三军医大学硕士学位论文具有肿瘤杀伤活性粒细胞的筛选及其体外抑瘤效应研究摘要粒细胞(Granulocytes)是指带有分叶核和丰富的胞质颗粒的细胞，是固有免疫系统的重要组成部分。传统观点认为，粒细胞主要在抵御微生物攻击中发挥作用，而在抗肿瘤免疫中作用则不大。近年来一系列动物模型的研究证据表明，某些小鼠来源的粒细胞具有很强的抗肿瘤活性，提示粒细胞作为新

2、型抗肿瘤效应细胞的潜力。但是动物模型中r的发现是否适用于人类，能否从在健康人群中筛选出具有肿瘤杀伤活性(cancerkilleractivity，CKA)的粒细胞，从而应用于肿瘤临床治疗，是一个有待探讨的问题。为此，我们从21名健康志愿者的全血中分离粒细胞，筛选出CKA粒细胞，初步研究CKA粒细胞的体外抗肿瘤作用及机制，并探讨人CKA细胞群体与不具有CKA粒细胞群体的分子差异，为肿瘤的细胞治疗提供新思路。目的：从21个样本中筛选CKA粒细胞，确定筛选获得的CKA粒细胞的体外抑瘤效应及抗肿瘤的可能机

3、制，探讨人源CKA细胞群体与不具有肿瘤杀伤活性粒细胞群体的分子差异。方法：1、CKA粒细胞的筛选：收集21份健康志愿者外周抗凝全血，从中分离粒细胞；分别将其与人肺癌A549细胞共培养，应用CCK一8法检测肿瘤细胞增殖活性，筛选CKA粒细胞。2、CKA粒细胞的体外抗肿瘤作用：通过CCK．8法，分别检测在不同效靶比、直接接触的共培养条件下，筛选获得的CKA粒细胞对正常人细胞株、肿瘤细胞株的体外杀伤作用。3、CKA粒细胞的体外抗肿瘤机制：在不同效靶比、直接接触的共培养条件下，通过双染法检测肿瘤细胞凋亡；

4、分别采用直接接触、Transwell共培养、条件培养液等共培养细胞方式，比较不同处理方式下，CKA粒细胞对肿瘤细胞的抑制作用。4、CKA细胞与不具有CKA粒细胞的差异分析：分别应用RealtimePCR与ELISA的方法检测CKA粒细胞与不具有CKA粒细胞之间TGFIBlmRNA表达量及蛋白含量的差异；应用TGFIB受体抑制剂Ly．364947阻断TGFIBl受体，观察处理后粒细胞抗肿瘤效应的变化。4第三军医大学硕士学位论文结果：1、21个样本中，有6个样本粒细胞克隆对肺癌细胞株A549具有明显的

5、抑制作用，CKA的比例为28．57％，其中克隆3对A549的抑制作用最强。2、克隆3的CKA粒细胞对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞Hela具有明显抑制作用，而对正常人成纤维细胞株MRC一5基本无抑制作用；CKA粒细胞的抑瘤效应随着效靶比的提高而增强。3、在直接接触后，克隆3的CKA粒细胞能诱导A549、HepG2、Hela细胞凋亡；三种处理方式的抑制效率比较：直接接触>Transwell>条件培养。4、相对于不具有肿瘤杀伤活性粒细胞，CKA粒细胞中TGFl31表达量(包括R

6、NA水平与蛋白水平)显著性降低(P<0．05)；经TGFf)受钵抑制剂(LY-364947)处理，CKA粒细胞的抗肿瘤作用增强；其增强效应与抑制剂使用浓度正相关。结论：1、与动物模型的结果类似，一定比例人体内也存在着CKA粒细胞。2、CKA粒细胞对不同肿瘤细胞及正常细胞的杀伤作用具有一定选择性。3、CKA粒细胞能高效诱导肿瘤细胞的凋亡，其对肿瘤细胞的杀伤需要直接接触。相对于不具有肿瘤杀伤活性粒细胞，CKA粒细胞中TGFl31表达量低，抑制TGFl31有助于增强CKA粒细胞的抗肿瘤作用。4、CKA粒

7、细胞对肿瘤细胞的杀伤作用可能与其对肿瘤细胞的趋化、粘附作用有关。5、增加肿瘤微环境中的CKA粒细胞数量和活性，有可能成为肿瘤治疗的一种新途径。关键词：粒细胞；肿瘤杀伤活性；TGFpI第三军医大学硕士学位论文Screeningthegranulocyteswithcancerkillingactivityandobservationthe"。vilantitumorabiliUandobseationtheirinvitroantl-tUmoraOilltyAbstractGranulocytesp

8、layimportantrolesininherentimmunity,withhighabilitytopreventtheinvasionofmicroorganismbutdonotresponseeffectivelytocancercells．Recently,aseriesofexplorationsinmousemodelshaveindicatedthatgranulocytesfromsomemicehavestrongantineoplasmicactivity