淀粉糖化酶抗体的研制及其双抗夹心elisa法的初步建立与应用

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1、分类号——UDC——学位论文学号丛Q窆QZ箜密级——淀粉糖化酶抗体的研制及其双抗夹心ELISA法的初步建立与应用指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：学位授予单位：张丹硕士2Q12生垒月扬刿盘鲎答辩委员会主席：论文评阅人一学科专业名称：堕鏖蔓匡堂论文答辩日期：2Q12生§月学位授予日期：2Q12生鱼旦2012年6月淀粉糖化酶抗体的研制及其双抗夹心ELISA法的初步建立与应用PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstGlucoamylaseandEstablishmentandPr

2、eliminaryApplicationoftheDouble—antibodySandwichELISAMethod研究生：张丹导师：王捍东教授学科：临床兽医学M．S．Candidate：ZhangDanSupervisor：Prof．WangHandong扬州大学兽医学院临床兽医学教研室2012年6月中文摘要淀粉糖化酶(GA)能将淀粉转化成低分子量糖类，在制糖行业得到了广泛应用，在这样的植物糖制品中一般都有糖化酶的残留。蜂蜜中葡萄糖和果糖的含量约为65％，是极易以糖掺假的食品。近年来，我国蜂蜜质量安全问题不断出现，2002

3、年欧盟及一些国家对中国蜂蜜采取禁进和停止销售的贸易壁垒，给中国养蜂业带来了很大的损失。因此，为了监测蜂产品中的掺糖造假，建立一种快速检测蜂蜜中掺入的外来淀粉糖化酶(失活或未失活)的方法具有十分重要的现实意义。蜂蜜中掺糖造假的检测方法主要有碳稳定同位素比值分析法(SlRA)、红外光谱鉴别法、高效液相色谱法等。SIRA对鉴定蜂蜜中掺入C4植物糖有很好的效果，但对掺入以C3植物为原料生产的淀粉糖不能鉴别，给检测蜂蜜是否存在植物糖掺假带来一定的困难：红外光谱鉴别法虽然前处理简单，操作步骤方便、快捷，鉴定的准确度较高，但是设备昂贵，操作

4、技术要求高；高效液相色谱法灵敏度高，但设备昂贵，前处理净化要求高。免疫学方法，特别是酶联免疫吸附法(ELISA)，由于其具有灵敏度高、检测速度快、特异性强、样品前处理简便、操作简单、实用性强的优点，得到了大范围的推广。本试验旨在研究一种快速准确检测蜂蜜中淀粉糖化酶残留的酶联免疫学方法。本研究采用淀粉糖化酶免疫新西兰大白兔，获得抗淀粉糖化酶的多克隆抗体，Western-blot检测显示，制备的多克隆抗体与GA有很好的特异性反应。并用淀粉糖化酶免疫原免疫BALB／c小鼠，利用杂交瘤技术和单克隆抗体技术获得了12株可稳定性分泌针对G

5、A抗体的杂交瘤细胞株，Western．blot检测显示，制备的单克隆抗体与GA有很好的特异性反应。对其中的6株单抗(McAb．2H4F9、6H9D8、8F2F11、8F2E9、1A8G6、1C4D5)细胞株采用体内诱生法制备腹水，腹水的效价均为1：1×104以上。采用抗体叠加试验对这6株抗糖化酶单抗的抗原识别位点进行检测，反应增值结果表明，6株单抗分别针对4类不同抗原位点，McAb．6H9D8和McAb．8F2F11针对同一抗原决定簇；McAb．1A8G6和McAb。1C4D5针对第11种抗原决定簇；McAb．8F2E9针对第

6、Ⅲ种抗原决定簇；McAb．2H4F9针对第Ⅳ种抗原决定簇。用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记McAb．6H9D8，为建立双抗夹心ELISA方法提供特异性的酶标抗体。分别用多抗和用单抗包被，建立双抗夹心ELISA方法。结果显示，以单抗包被为基础中文摘要Ⅱ一建立的检测方法特异性更强，灵敏度更高。本试验中，用特异性单抗和酶标特异性单抗相结合建立双抗夹心ELISA检测法。包被抗体(McAb-2H4F9)的最佳包被浓度为12mg／L，GA溶液的最佳稀释度为1：100，酶标抗GA单克隆抗体的最佳稀释

7、倍数为1：1000。研究结果表明，建立的双抗夹心ELISA方法特异性良好，与叶淀粉酶(a．G)和B．呋喃果糖苷酶(p．F)无交叉反应。将该方法初步应用到蜂蜜的检测中。当样品液作8倍以上稀释时，基本无基质干扰。在5"-一80ng／mL范围内，标准曲线方程为：Y=．0．4555x+1．2409，R2=0．9914。关键词：淀粉糖化酶；多克隆抗体；单克隆抗体；双抗夹心ELISA；蜂蜜AbstractPreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstGlucoamylaseandtheEstabli

8、shmentandpreliminaryApplicationoftheDouble-antibodysandwichELISAMethodM．S．Candidate：ZhangDanSupervisor：Prof．WangHandongABSTRACTGlucoamylas