暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物分子多态性及纤维素降解菌多样性研究

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1、华中农业大学博士学位论文暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物分子多态性及纤维素降解菌多样性研究姓名：黄胜威申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：张宏宇201206暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物分子多态性及纤维素降懈茵多样性研究捅要从生态学和进化角度来说，肠道微生物对宿主昆虫有着非常重要的作用。然而，肠道微生物种类和群落组成是否会随着宿主昆虫栖息地环境的变化而变化，目前鲜有报道，是值得深入研究的问题。本文研究了不同地理种群暗黑鳃金龟幼虫后肠肠道细菌群落组成和多样性，以及环境因子对肠道细菌群落组成和多样性的影响。同时，采用好氧培养技术，从暗黑鳃金龟幼虫后肠内分离了具有纤维素酶

2、产生能力的菌株，并从中克隆了纤维素酶基因，研究了肠道细菌对蛴螬的生理功能方面的作用。1．构建了10个不同地理种群暗黑鳃金龟幼虫肠道细菌的16SrRNA基因克隆文库，并通过变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)分析归类克隆子，挑取不同DGGE斑型(bandtype)对应的克隆子测序。结果表明幼虫肠道细菌可归为205个操作分类单元(OperationalTaxonomicUnits，OTUs)，分别属于厚壁菌f-j(Firmicutes)，变形菌门(Proteobacteria)，拟杆菌门(Bacteroid

3、etes)，放线菌门(Actinobacteria)和梭杆菌门(Fusobaeteria)。比较不同地理种群暗黑鳃金龟幼虫肠道细菌群落及组成，可以发现以下几个特征：(1)厚壁菌门和变形菌门细菌为肠道细菌优势细菌类群。厚壁菌门中的梭菌纲细菌广泛存在于所有10个地理种群蛴螬肠道内，且为肠道细菌绝对优势菌群。B．变形菌纲，Y一变形菌纲和￡-变形菌纲的细菌也广泛存在于10个地理种群样本蛴螬肠道内，只不过与梭菌纲细菌相比，所占比例较小。拟杆菌门，放线菌门和梭杆菌门细菌的分布则非常不均匀，在有些种群的蛴螬肠道内有分布，有些种群肠道内则没有。(2)有6种OTUs代表的细菌遗传型为所

4、有地理种群的蛴螬所共有，在10个种群蛴螬肠道细菌克隆文库内都有发现。其余的细菌遗传型在地理种群样本肠道内则呈不均匀分布：很多细菌遗传型只存在特定的地理种群蛴螬肠道内，在其他种群的蛴螬肠道内没有分布。(3)不同种群蛴螬肠道细菌群落多样性存在很大差异：天津种群肠道细菌种类数最少，为38．8，而福建种群肠道细菌丰富度最高，细菌种类数为86．5。J-LIBSHUFF分析发现绝大部分种群肠道细菌克隆文库组成之间存显著性差异。(4)相关分析(Spearmannonparametriccorrelationtest)和冗余分析(Redundancydiscriminateanaly

5、sis，RDA)结果显示，不同地理种群蛴螬肠道细菌群落组成和多样性方面的差异，与宿主昆虫栖息地环境条件密切相关。宿主昆虫栖息的土壤理化条件(如土壤pH，土壤有机质含量和土壤全氮量)，以及栖息地的气候条件(年平均1华中农业大学博士学位论文温度，一月份最低温和年降雨量)等环境因子，都可以显著影响蛴螬肠道细菌多样性和群落组成。2．从暗黑鳃金龟幼虫后肠内分离到207株纤维素降解菌。通过核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(AmplifedRibosomalDNARestrictionAnalysis，ARDRA)分型后，结合代表菌株16SrDNA测序比对结果和生理生化试验结果

6、，所有这些纤维素降解菌可以归为21种不同的细菌，分布在4个不同的门：变形菌门，放线菌门，厚壁菌门和拟杆菌门，其中，变形菌门细菌为纤维素降解菌中最优势的细菌类群。假单胞菌属Pseudomonas，纤维菌属Cellulosimicrobium，苍白杆菌属Ochrobactrum，根瘤菌属Rhizobium和微杆菌属Microbacterium为最主要的属。而属于芽孢杆菌属Bacillus，发酵成对杆菌属Dyadobacter，Siphonobac饱r属，副球菌属Paracoccus，Kaistia属，德沃斯氏菌属Devosia，Labrys属，剑菌属Ensife尸，贪食菌

7、属Variovorax，Shinella属，柠檬酸杆菌属Citrobacter和寡养食单胞菌属Stenotrophomonas的细菌也被分离得到，只不过所占比例较小。此外，在本研究中，有一些种类的细菌，如Siphonobacteraquaeclarae，芬氏纤维微菌Cellulosimicrobiumfunkei，Paracoccussulfuroxidans，弗氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii和硝化还原假单胞菌Pseudomonasnitroreducens都是首次被报道具有纤维素降解活性。3．本研究使用兼并引物同源克隆并结合染色