zic1基因对胃癌细胞周期和细胞迁移的影响及其调控机制研究

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1、浙江大学硕士学位论文ZIC1基因对胃癌细胞周期和细胞迁移的影响及其调控机制研究姓名：钟菁申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：王良静20120219浙江大学硕十学位论文中文摘要z肋基因对胃癌细胞周期和细胞迁移的影响及其调控机制研究浙江大学医学院内科学硕士研究生钟菁导师王良静中文摘要我们前期采用cDNA微阵列分析(cDNAIIlicroa册y)和启动子甲基化检测发现Z配』(zillcfingerof恤cerebellum1)基因在胃肠癌细胞和组织中沉默表达或显著表达显著下调，这种低表达现象与启动子高甲基化相关。Z，C，基因是刁C基因家族

2、成员之一，定位于人类3号染色体长臂，具有三个外显子结构和Cys2His2锌指结构域，转录产物是重要的C末端锌指转录因子。近年来的研究表明，Z明基因除了在神经嵴和脑发育过程起重要作用外，还与髓母细胞瘤、子宫内膜癌、硬纤维瘤和脂肪肉瘤等肿瘤的发生发展密切相关。但有关刁a基因对胃癌肿瘤生物学行为的影响和相关分子机制未见文献报道。细胞增殖和细胞周期调控对胃癌发生发展起关键作用。已经证实Sollichedgehog(Sllll)信号通路与胃癌的发病机制联系密切，可以调控胃癌细胞的分化和增殖。MAPK和P13K信号通路是调控细胞增殖的重要信号通路，

3、这两条信号通路的激活还参与细胞周期特别是G1．S期的调控。本课题采用现代细胞与分子生物学技术，通过建立外源性过表达Z，CJ的胃癌细胞系，了解胃癌发生中z，a基因对细胞增殖、细胞迁移及细胞侵袭等重要生物学功能的影响，并进一步探讨刁C，对胃癌发生中脚K、PI，K和S}111信号通路的分子调控机制。同时采用基因芯片技术对刁C』下游相关靶基因进行系统筛选，并对关键基因进行验证以明确其对细胞周期和细胞迁移的作用机制。IH浙江大学硕：L学位论文中文摘要方法和材料：1．将胃癌细胞稳定转染pcDNA3．1和pcDNA3．1．zIcl载体后，采用MTS及

4、Transwell试验检测Z，CJ『对胃癌细胞生物学行为(细胞增殖、迁移及侵袭)的影响。2．采用流式细胞仪分析过表达刁CJ后胃癌细胞周期和细胞凋亡的变化，采用Westemblot检测细胞周期相关蛋白(p21，p27，cycliI山1)和细胞增殖MAPK、P13K信号通路关键蛋白(心，Erkl／2)的变化。3．通过建立外源性过表达z，CJ胃癌细胞株，探讨其对Sllll蛋白表达的影响；进一步利用Cyclop枷ne阻断S11ll信号通路，研究对细胞周期关键蛋白(p21，cyclillDl)的表达及其对胃癌细胞迁移的影响。4．MKN28细胞稳定

5、转染pcDNA3．1空白载体和pcDNA3．1．Zlcl后，分别收集I矾A逆转录为cDNA，利用基因表达谱芯片技术检测筛选刁CJ『可能的下游调控基因，并对其中三个基因aW洲弛删3脚J『，4删尸进行Q—PCR验证。结果：1．过表达刀a可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。过表达z，CJ后BGC823胃癌细胞增殖在第1天和第3天显著减慢(p<0．001)。过表达Z捌后AGS，BGC823和SGC790l细胞迁移数量显著减少p

6、步调控了关键细胞周期相关蛋白的表达。外源性过表达刁C-后AGS和SGC7901胃癌细胞在细胞周期G1期DNA的含量增多，而S期DNA含量相应降低。胃癌细胞过表达刀CJ可显著上调细胞周期相关蛋白p21，p27的表达，同时抑制cyclinD1表达。过表达z，CJ后AGS，MKN28，BGC823和SGC7901细胞株的p．Erkl／2和p．Ah活性蛋白表达明显降低，而总蛋白Erkl／2和Akt无明显改变。IV浙江大学硕士学位论文中文摘要3．嬲对胃癌细胞周期蛋白和胃癌细胞迁移的调控可能与抑制Shh信号通路有关。过表达z，CJ『后胃癌细胞株彤册

7、II删A的表达明显下降p<0．01)，Sllll蛋白表达水平显著下调。CyclopalIline药物处理抑制S11Il信号通路后胃癌细胞刁CJ『mRNA表达水平未见明显变化，细胞周期相关蛋白p21表达上调，cycliIDl表达下调。另外，Tr趾swell迁移试验发现Cyclop锄ine药物处理后胃癌细胞迁移数量显著减少p<0．001)。4．筛选和验证胃癌细胞刁a调控下游候选基因。通过人类全基因组芯片筛选出刁CJ下调下游基因132个，上调基因66个，功能归类分析显示差异基因主要参与细胞周期、细胞增殖、细胞迁移和转录调控等。挑选代表性基因C

8、j粥：?、7羽。彳尺月硎鹧删．；胛J『进行Q．PCR验证，结果与芯片检测结果基本相符。毫结论：1．过表达刁C，抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为。，2．过表达Z，CJ显著抑制触、Erkl／2磷酸化水平