wnt5a基因在乳腺癌中表达和临床意义及其机制的研究

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1、复旦大学博士学位论文Wnt5a基因在乳腺癌中表达和临床意义及其机制的研究姓名：严婷婷申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：陆劲松2012-04-10中文摘要复旦大学博士学位论文Wnt5a基因在乳腺癌中表达和临床意义及其机制的研究目的在临床上激素受体阳性的乳腺癌患者的预后较阴性的患者好，激素受体阳性也是运用内分泌治疗的指征，因此调节激素受体的表达具有重要的临床意义。miRNA-206通过与雌激素受体(ER)3’．非翻译区结合从而抑制ER的表达。术后辅助内分泌治疗联合唑来膦酸研究结果显示其可能具有直接的抗肿瘤作用以及增强内分泌治疗疗效的作用。Wnt信号通路和肿瘤的发生发展密切

2、相关，其中Wnt5a的表达与乳腺癌激素受体表达密切相关，但是Wnt5a基因对乳腺癌生物学行为影响、调控雌激素受体表达的机制以及唑来膦酸增强内分泌疗效的作用机制尚无深入研究。本课题旨在研究Wnt5a基因对人乳腺癌细胞生物学行为的影响和在乳腺癌中表达的临床意义以及此基因多态性与乳腺癌发病风险以及激素受体表达间的相关性，探索其调节雌激素受体表达可能的机制。方法第一部分1．设计并合成对人Wnt5a基因的RNA干扰片段，将siRNA片段瞬转入ER阳性人乳腺癌细胞株下调其Wnt5a基因表达水平，用Western．blot方法验证下调Wnt5a蛋白表达的有效性，观察下调此基因后对细胞ER

3、蛋白表达的影响；分别用CCK。8试剂盒以及Transwell小室测定Wnt5a基因下调后对细胞增殖水平以及体外侵袭能力的影响。2．用实时定量PCR(real．timePCR)检测ER阳性和ER阴性人乳腺癌细胞株miRNA．206表达差异以及下调ER阳性人乳腺癌细胞株Wnt5a基因表达水平后对rnjI斟A．206表达的影响。2中文摘要复旦大学博士学位论文3．用mimic．miRNA．206和inhibitor-miRNA．206瞬时转染ER阳性人乳腺癌细胞株，用real．timePCR验证上调和下调miRNA．206表达水平的有效性并观察此小RNA表达水平的改变对Wnt5a以

4、及ER蛋白表达的影响。4．采用CCK-8试剂盒以及PI染色流式细胞计数法(flowc”ometry，FCM)检测唑来膦酸对ER阳性人乳腺癌细胞增殖以及凋亡的影响。5．Western-blot法检测唑来膦酸对ER阳性人乳腺癌细胞株ER、WntSa以及自噬蛋白表达水平的影响。6．CCK．8试剂盒检测下调ER阳性人乳腺癌细胞Wnt5a基因后对唑来膦酸敏感性的影响7．透射电镜观察唑来膦酸诱导乳腺癌细胞产生自噬体。8．用CCK．8试剂盒检测唑来膦酸联合氟维斯群对人乳腺癌细胞株增殖能力的影响，Western．blot法检测两药联合对乳腺癌细胞ER、Wnt5a蛋白表达的影响。第二部分《1

5、．收集乳腺癌患者741例以及对照良性乳腺疾病患者293例，病例组与对照组根据年龄匹配，签署知情同意书后获取外周血5ml。京2．提取外周血DNA，对于Wnt5a的单核苷酸多态性(SNP)位点进行检测。候选SNP位点由ABI公司开发的SNPbrowserTMv4．0软件来选择。3．对于Wnt5a基因多态性位点与乳腺癌易感性以及乳腺癌患者中Wnt5a基因多态性与临床病理特征之间的关系进行统计学分析。第三部分收集2005年01月～2005年12月间复旦大学附属肿瘤医院病理确诊的女性原发性乳腺癌标本218例临床病理资料和肿瘤组织蜡块标本，对所有入组病例进行随访，运用免疫组化方法检测乳

6、腺癌肿瘤组织中Wnt5a的表达。研究Wnt5a的表达与乳腺癌患者临床病理特征以及预后的关系。分析其表达与临床病理特征以及预后的关系采用卡方检验。生存曲线用Kaplan．Meier法计算。多因素分析采用COX比例风险模型进行，以P<0．05为差异有统计学意义。数据分析采用statal0．0软件进行统计学分析。3中文摘要复旦大学博士学位论文结果；日爿K第一部分1．下调MCF．7细胞Wnt5a基因表达水平后可以抑制ER蛋白的表达，并且可以促进细胞增殖，但对细胞侵袭能力无影响。2．ER阳性的乳腺癌细胞株MCF．7的miRNA．206表达水平低于ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-2

7、31细胞株；下调MCF．7细胞Wnt5a基因表达后miRNA．206表达增高。3．上调MCF一7细胞miRNA-206表达后可抑制其Wnt5a以及ER蛋白的表达水平；抑制MCF-7细胞miRNA．206表达后对Wnt5a以及ER蛋白表达无明显影响。4．唑来膦酸可以抑制MCF．7细胞增殖、诱导其凋亡并且具有浓度依赖性。5．唑来膦酸可以抑制MCF．7细胞株的Wnt5a以及ER蛋白的表达，另外还可以诱导自噬标记蛋白LC3．II表达增多。6．下调MCF．7细胞株的Wnt5a基因表达水平后对唑来膦酸的敏感性降低。7．透射电镜