tff3在断奶腹泻仔猪肠道中的分布表达及对肠黏膜上皮细胞的作用

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1、华中农业大学硕士学位论文TFF3在断奶腹泻仔猪肠道中的分布表达及对肠黏膜上皮细胞的作用姓名：邓荣申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：周东海201206TFF3在断奶腹泻仔猪肠道中的分布表达及体对肠黏膜上皮细胞的作用摘要肠三叶因子(Trefoilfactorfamily3，TFF3)是一种具有59个氨基酸残基组成的成熟短肽，已知TFF3可以在动物的肠道上皮细胞中表达，它们常常由黏液细胞中的黏蛋白一起分泌，主要以单体或二聚体的形式存在，TFF3具有增强上皮的完整性和促进黏膜重建和修复作用，在病理条件下，TFF3表达的组织特异性将发生改变，黏膜出现损伤时可诱导其表达。断奶是养猪业中最大的

2、应激因素之一，此时仔猪面临着心理和生理上的应激，如与母猪及同窝仔猪的分离，饲料的巨变、环境以及与不认识的仔猪共同生活等多方面的影响而容易引发“早期断奶综合征”。肠黏膜上皮细胞是构成肠道屏障的重要成分，体外已有很多实验证明TFF3在肠道疾病中具有重要的作用，其表达与出生后肠的发育程度尤其是断奶时期肠的发育程度具有很大的关系。本研究在建立仔猪断奶腹泻模型的基础上观察断奶仔猪出现腹泻时TFF3蛋白在肠道各段中的分布及表达情况；细菌内毒素是所有数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，并且对免疫系统及炎症的发生具有重要的刺激作用，它可以调节黏蛋白及细胞因子的表达，本试验在成功培养原代肠黏膜上皮细胞的基础上

3、，添加不同浓度的内毒素及一定量的重组人小肠三叶因子(栅F3)，观察rhTFF3防治内毒素对细胞的损伤作用，并了解内毒素及rhTFF3对仔猪肠黏膜上皮细胞中TFF3基因表达的影响。以体重为(10-士0．3)kg，25"--，28日龄的早期断奶仔猪24头为研究对象，通过口服肠毒素性大肠杆菌制作腹泻模型，选取其中腹泻比较明显的9头仔猪作为试验组，另外选9头健康仔猪作为对照组。分别在仔猪出现腹泻的第ld、3d和5d屠宰仔猪(试验组和对照组3只／次)并采集样品，采用免疫组织化学方法观察仔猪肠道各段中TFF3蛋白的变化，选用Image．proplus图像分析软件对TFF3蛋白阳性表达率进行分析，以细胞

4、质染成棕黄色为阳性表达，并根据软件测定的平均光密度(MeanDensity)来表示TFF3蛋白的表达情况，所得结果均采用SPSS13．0统计软件进行分析。取初生未吃初乳仔猪的小肠组织，采用酶消化法分离培养仔猪小肠黏膜上皮细胞。原代细胞传代后接种于96孔板中，分别于添加内毒素前后添加rhTFF3，通过MTT法检测rhTFF3防治内毒素对细胞活力的影响；并将长满80％时的原代细胞分为试验组和对照组，试验组分为四组，培养液中分别添加终浓度为1、10、100lxg／ml的内毒素及50rtg／ml的rhTFF3，对照组添加生理盐水，作用24h后利用荧光定量华中农业大学2012届硕士学位论文PCR技术

5、检测细胞中TFF3基因表达的变化，分析内毒素及rhTFF3对仔猪肠黏膜上皮细胞中TFF3基因表达的影响。研究发现TFF3蛋白在仔猪的肠道各段均有表达，且主要分布于小肠和大肠的黏膜组织；随着日龄的增加，TFF3蛋白的表达量也随之出现上升的趋势，以空肠和回肠最为明显；腹泻仔猪肠道中TFF3蛋白的表达与对照组相比，其表达量相对较高并具有差异性，可能与TFF3在仔猪断奶后应激性腹泻中具有保护肠黏膜屏障完整性的作用有关。免疫组织化学发现TFF3蛋白在肠黏膜上皮细胞中有表达，rhTFF3可以有效预防内毒素对肠黏膜上皮细胞的损伤(P<0．05)，且对不同浓度的内毒素的预防作用差别很大(P<0．05)，大

6、概因为不同浓度的内毒素对细胞的损伤作用具有差异性；当上皮细胞中添加不同浓度的内毒素作用24h后，与对照组相比，低浓度(1、10pg／m1)内毒素可抑制TFF3基因的表达；高浓度(100“g／m1)的内毒素可促进TFF3基因的表达；而加入rhTFF3时，细胞中TFF3基因的表达也会相对降低，可能是细胞具有一定的抗损伤能力而使得低浓度的内毒素不能造成细胞损伤，间接表现在对细胞损伤具有防治功能的TFF3的表达量出现差异。关键词：仔猪；腹泻；肠三叶因子；肠黏膜上皮细胞；内毒素IITFF3在断奶腹泻仔猪肠道中的分布表达及体对肠黏膜上皮细胞的作用ABSTRACTTFF3(Trefoilfactorfa

7、mily3)isamaturepeptidecomposedof59AAs．TFF3areknowntobeexpressedinintestinalepithelialcellsofvariousorganismsandareoftenCO-secretedwithmucinsbymucus-producing．TFF3issecretedasamonomerordimer．TFF3provideprotectivea