plmvd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析

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1、华中农业大学硕士学位论文PLMVd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析姓名：康彦平申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王国平201206PLMVd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析摘要桃潜隐花叶类病毒(Peachlatentmosaicviroid，PLMVd)是危害桃等核果类果树的一类重要病原物，导致产量降低，品质下降，树势衰退。PLMVd在桃树上可引起叶片表现花叶、褪绿和白化等症状。我们前期调查发现，我国许多栽培桃上发生一种新的疑似PLMVd的病害，该病在多数桃树上表现沿叶脉褪绿和沿叶缘褪绿症状，在少数桃树上还表现出黄化症状，但这些症状是否由PLMVd引起不明确。本文

2、对从田间发病植株上分离得到的PLMVd分离物进行体外构建侵染性RNA，接种GF305实生苗并与PLMVd进行症状比较分析，并对相关分离物的分子变异进行了研究。主要结果如下：1、以来源于田间表现沿叶脉褪绿、沿叶缘褪绿症状和黄化的5个PLMVd分离物的优势分子变种克隆(DXH．2．1、DXH．14．1、DXH．12．1、DXH．5．1和WH．5．3)为试材，将该类病毒cDNA进行二聚体化连接至pGEM．18T载体，体外转录获得PLMVd二聚体RNA，温室内机械接种至桃GF305实生苗，接种后进行症状观察和RT-PCR鉴定。RT-PCR检测表明，接种15d后，5个分离物均可检测到。接种150

3、d后，DXH．14．1和DXH．12．1表现沿叶缘褪绿症状，DXH．5．1表现轻微黄化症状，WH．5．3前期表现严重的黄化症状，后期转变为白化症状，这些症状均与PLMVd田间发病相同，表明我国桃树上沿叶缘褪绿和黄化症状系由PLMVd引起。DXH．2．1接种后一直没有表现症状，而该分离物来源于田间表现沿叶脉褪绿症状的病株，初步推测沿叶脉褪绿的症状不是由PLMVd引起。2、对GF305实生苗中PLMVd接种后代进行了克隆测序，每个分离物选取10个克隆进行了序列分析，结果显示，各后代序列与原始序列的同源率分别为97．9～98．8％、97．9～98．5％、97．6～98．8％、99．4～100

4、％和97．6～99．7％。在分离物DXH．5．1和WH．5．3后代序列中可以发现2．4个亲本序列或与亲本高度近似的序列(少于2个突变位点)，而分离物DXH．2．1、DXH．14．1和DXH．12．1后代序列与亲本序列相比发现有4．7个突变位点。结果表明所有接种序列均在寄主内发生了变异，推测这可能是造成DXH．14．1和DXH一12—1接种植株未全部表现出与田问相同症状的原因，但接种不同序列后代变异程度存在差异的原因有待进一步研究。在PLMVd各后代序列中均发现了重组序列，数量为1．7个，PLMVdA环(203．208nt之间)上的6华中农业大学2012届硕士研究生学位论文个碱基被完整替

5、换为寄主的17个碱基，在原来的位置形成新的颈环结构。为排除变异和重组因体外构建侵染性RNA操作造成的可能，本研究选取DXH．14．1和DXH．12．1进行体外转录和转录产物的序列测定分析，结果显示经过转录、RT-PCR后后代序列变异程度远低于体内获得的变异。3、为进一步了解PLMVd的分子变异规律，将以上5个分离物及分离物DXH-3—1的克隆体外合成带粘性末端的单体eDNA，接种金水二号梨离体植株，对各分离物子代序列分析表明，接种后代碱基突变的位置主要分布在LoopA、耶丁I臂和第150nt，各分离物后代序列与原始序列完全相同的数目分别为6(DⅫ．3．1)、0(DXH．2．1)、11(

6、DXH．14．1)、l(DXH．12．1)、l(DXH．5．1)和19(WH．5—3)。而在分离物DXH．3．1、DXH．2．1、DXH．14．1、DXH．12．1、DXH．5．1和WH．5．3的变异序列间分别有1、18、8、0、8和0个子代序列与原始序列表现出很高的同源率(≥99％)，且分子内的同源率分别为97．9～100．0％、97．9—100．0％、96．9-100．0％、97．3～100．0％、98．6～100．0％和98．6～100．0％。关键词：类病毒，桃潜隐花叶类病毒，病原鉴定，分子变异PLMVd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析ABSTRACTPeachlatent

7、mosaicviroid(PLMVd)isanimportantpathogenwhichcaninfectstonetreessuchaspeach．Itseriouslyaffectstheyield，fruitqualityandgrowth．PLMVdcaninducemosaic，chlorosis，andyellowingofpeach．Previously，occurrenceofPLMVdwasconfirmedinmanype