mmp-9基因3'utr多态性与动脉粥样硬化性脑梗死相关性及mirna-491介导的多态调控机制研究

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1、中南大学博士学位论文MMP--9基因3'UTR多态性与动脉粥样硬化性脑梗死相关性及miRNA--491介导的多态调控机制研究姓名：袁梅申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：杨期东；夏健20120526博士学位论文中文摘要背景与目的：脑卒中是当前严重危害人类健康的世界性问题，具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高等特点。缺血性脑卒中(Ischernicstroke，IS)占脑卒中总发病率的70％，由环境因素与遗传因素共同作用所导致，其中动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是最常见的病因和基本病理变化

2、。细胞外基质金属蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase9，MMP．9)是介导动脉粥样硬化发病的一种重要炎症介质，高表达的MMP．9可促进动脉粥样硬化形成以及斑块破裂，不仅如此，MMP．9在IS的发生、发展以及预后的病理过程中发挥着重要作用。遗传多态性是脑血管病分子遗传机制的研究热点，有关MMP-9基因3’非翻译区(3’UTR)多态性与动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)相关性的研究国内外尚未见报道，因此，探讨MMP-9基因3'UTR多态性与ACI的相关性意义重大。微d、RNA(microRNA，miR_NA)

3、是一类内源性的约19-25个核苷酸大小的非编码RNA分子，能通过碱基匹配原则识别靶基因3’UTR的特异性序列，抑制靶基因的翻译和(或)降解靶基因，从而在转录后水平沉默特定基因，对生物体基因表达起精细调节的作用。因而，我们推测m9基因3’UTR的多态性可能引起相应miRNAs与之结合发生改变，从而介导多态调控模式下的MMP．9表达水平的改变。在本本研究得到湖南省自然科学基金资助(编号：11JJ3098)I博士学位论文．中文摘要研究中我们进一步探讨了脚9基因3’UTR多态性对动脉粥样硬化性脑梗死发病机制的影响。材料和方法：本

4、研究拟通过病例．对照研究，连续收集2008年3月至2011年3月在中南大学湘雅医院神经内科就诊的湖南汉族动脉粥样硬化性脑梗死患者340例以及与之相匹配的正常对照组309例。利用聚合酶链反应(PCR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI．TOF．MS)对MMP-9基因3’UTR五个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs20544、rsl056628、rsl802908、rs2664517和rs9509)进行基因分型检测，分别比较不同基因型及等位基因频率与ACI发病风险之间的关系。进一步构建了PGL3．蚴很9(包括

5、编码区以及3’UrR)野生型和突变型(rs1056628A--争C)重组表达质粒以及pcDNA3．1-miR-491重组表达质粒，共转染人脐静脉内皮细胞(琢ⅣEC)培养后，运用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度，验证miR．491是否与MM-P．9野生型3’UTR重组质粒结合以及明确突变型(rsl056628A---，C)是否影响miR-491与靶基因的结合。再进一步合成miR-491-5p(表示从miR-491的5’端加工而来)模拟物和抑制物，分别与MMP-9基因野生型和突变型重组质粒共同瞬时转染到HUVEC，分

6、别运用RT．PCR和ELISA从转录和翻译水平来检测蚴毋夕的表达，明确miR-491是否影响MMP-9mRNA的稳定性及其翻译水平。结果：1．在中国湖南地区汉族人群中，存在MMP-9基因rs20544、II博士学位论文中文摘要rsl056628和rs9509多态性，未发现rsl802908及rs2664517位点多态性：2．MMP-9基因rs20544位点CC、CT、TT基因型频率在ACI组和对照组分别为0．47I／0．405／0．124，0．489／0．382／0．129；cfr等位基因频率分别为0．674／0．326

7、，0．680／0．320，两组间等位基因频率及基因型分布比较无统计学差异(P>0．05)。3．MMP-9基因rs9509位点TT、TC、CC基因型频率在ACI组和对照组分别为0．491／o．418／0．091，0．466／0．447／o．087；T／C等位基因频率分别为O．700／0．300，0．689／0．311，两组间等位基因频率及基因型分布比较无统计学差异(P>O．05)。4．MMP-9基因rsl056628位点AA、AC、CC基因型频率在ACI组和对照组分别为0．594／0．332／0．074，0．709／0．2

8、62／0．029；A／C等位基因频率分别为0．760／0．240，0．840／0．160，两组间基因型及等位基因频率分布均存在统计学差异(P