microrna34a在绒毛膜细胞癌细胞株jeg-3中的表达及作用研究

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1、河北医科大学硕士学位论文MicroRNA34a在绒毛膜细胞癌细胞株JEG--3中的表达及作用研究姓名：白莎莎申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：庞义存201203中文摘要MicroRNA34a在绒毛膜癌细胞株JEG．3中的表达及作用研究摘要目的：绒癌(choriocarcinomaCC)是一种高度恶性的肿瘤，早期即可发生血行转移，导致全身播散。虽然目前化疗效果比较好，但随着耐药病例的出现，使绒癌的治疗出现了新的困难。因此，如何提高这部分患者的治愈率及生存率是临床医生所面临的一个难题。microRNA(miRNA)是

2、一类广泛存在于真核生物中，长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，能通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而在转录后水平对基因的表达进行调控。它们与人类的生长发育、干细胞分化与自我更新以及肿瘤、心脏疾病、艾滋病等多种疾病关系密切，尤其在肿瘤的发生发展过程中，扮演着重要角色。miR-34最先发现于线虫，并在一些非脊椎动物中保持同源性，是一类保守的、非编码miRNA。人类miR一34包括miR．34a、miR．34b和miR．34c等，基因结构的预测结果表明：成熟mir-34a序列位于其主

3、基因原初转录本外显子l下游约30kb的外显子2内；成熟mir-34b序列位于该基因原始转录本的内含子l内；mir-34c序列位于同一主基因原初转录本的外显子2内。根据miRBase序列数据库及ensembl数据库资料显示：has．mir．34a定位于lp36．23，其茎环结构序列位于1号染色体第9、134、314位歪第9、134、423位负链上，共计110个核甘酸序列；has．mir-34b和has．mir-34c共同位于llq23．1，前者茎环结构序列位于1l号染色体第110、888、873位至第110、888、956

4、位正链，共计84个核苷酸序列；后者茎环结构序列位于该染色体第110、889、374位至第110、889、450位正链，共计77个核苷酸序列。miR34在多种肿瘤中都呈现非正常表达。miR-34通过被p53激活，抑制E2F3、Bcl．2、c．myc、CDK4、CDK6、CyclinD1以及CyclinE2的表达，使肿瘤细胞停滞在Gl期，抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，并通过E2F3、SIRTl与p53形成正反馈环路，不断增强其自身和p53的作用。最近研究证实，miR34能够在多种肿瘤细胞中表达：人类结肠癌的发展过程中

5、miR34a的表达下调，在胰腺癌肿瘤细胞和儿童神经母细胞瘤(neuroblastoma)中miR34a的表达经常缺失；同时人为提高中文摘要miR34a的表达能够抑制细胞增殖并激活细胞凋亡途径。这些研究表明miR34a表达的下调或缺失与肿瘤的发生和细胞增殖之间存在着联系，miR34a的表达对抑制细胞增殖，激活细胞凋亡途径有重要意义。ValeryTarasovl等研究证实，miR34a是P53基因的直接靶标之一，染色体免疫沉淀反应和荧光素酶分析证实P53基因活化miR34基因转录，miR34家族的miRNA可以和P53的其它

6、靶标，如P21和BAX一起，在可促使恶性肿瘤发生的应激条件下促进细胞生长停滞和死亡的发生。P53基因做为～种细胞增殖负调节因子，调控细胞的生长和分化，维持基因组DNA的稳定，其突变或缺失所致的P53失功能可能在肿瘤发生、发展中起着重要的作用。研究发现P53基因与滋养细胞肿瘤的生物学行为有密切关系。P53基因的表达与葡萄胎滋养细胞的增生程度有关，并且P53的细胞凋亡调控水平失衡对于葡萄胎由良性转变为恶性起了重要作用。同时研究发现，在MCF。7细胞系中加入能够激活p53基因的依托泊昔(etoposide)能够诱发大小约为3．

7、7kb的mir-34a原初转录本(pri．mir-34a)的表达。因此，本实验通过应用依托泊苷作用于入绒毛膜癌细胞株JEG。3，以期上调microRNA34a(miR34a)在入绒毛膜癌细胞株JEG．3中的表达，同时观察不同药物作用时间内miR34a表达情况，并检测不同时间JEG．3绒癌细胞增殖和凋亡的情况，探讨miR34a在绒癌发生发展过程中的作掰，为绒癌的诊断和基因治疗提供理论依据。方法：1．用含15％胎牛血清的RPMI．1640培养JEG一3细脆，37℃、5％C02细胞培养箱中培养。2．利用临床应用化疗药依托泊营体

8、外上调入绒毛膜癌JEG．3细胞中miR34磙达，将培养细胞分为：对照组(常规培养，未进行任短处理)、加药6小时、12d"时、24d"时和48小时组。3。倒置显微镜下观察细胞形态学变化。4．一步法Trizol提取细胞中总RNA，实时定量PCR方法检测各组细胞miR34a表达情况，实验重复三次。5。四甲基偶氮唑蓝(MTT