mcrt-spd1嵌合基因的融合蛋白用于抗肿瘤免疫治疗的实验研究

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1、分类号R392密级公开UDC610硕士学位论文mCRT-sPD1嵌合基因的融合蛋白用于抗肿瘤免疫治疗的实验研究学位申请人：汪龚泽学科专业：免疫学指导教师：刘朝奇教授二○一二年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineExperimentalStudiesofRecombinantmCRT-sPD1inAnti-tumorImmunotherapyGraduateStudent:WangGongZeMajor:Immunology

2、Supervisor:Prof.LiuChaoQiChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2012三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在

3、校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：肿瘤的免疫逃逸是肿瘤得以发生、发展的关键因素，其中肿瘤诱导大量的免疫抑制分子构成的信号通路有效的抑制了免疫系统对肿瘤组织的杀伤效

4、应。本研究主要设计并表达小鼠钙网蛋白(Calreticulin,CRT)与可溶性程序性死亡受体1（programmedcelldeath1）胞外段的融合蛋白CRT-sPD1，并论证融合蛋白阻断PD1/PDL1信号通路并靶向的将具有促进抗原提呈的CRT携带到肿瘤分子表面诱导特异性抗肿瘤免疫应答，介导免疫系统对肿瘤的杀伤和清除作用。方法：(1)利用PCR技术从小鼠脾脏淋巴细胞的cDNA中获取截短的CRT和PD1的目的基因并构建pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表达质粒。(2)将pcDNA3.1(+

5、)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1和pcDNA3.1(+)（阴性对照）质粒转染B16-F1细胞，通过G418筛选后，挑取阳性克隆扩大培养，westernblot鉴定CRT、PD1、CRT-sPD1在B16-F1细胞中表达，并利用ELISA法和流式细胞术（FCM）检测融合蛋白分泌到细胞上清中，并能与EL4细胞膜上高表达的PDL1结合。(3)收集转染后各克隆株细胞上清与淋巴细胞混合共培养，MTT法检测融合蛋白对淋巴细胞增殖能力的影响；将CFSE染色后淋巴细胞与稳定表达细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况及乳酸脱氢

6、酶法检测致后敏淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤作用。(4)动物实验；将转染后各细胞株分别打入小鼠右背部皮下，观察肿瘤的生长，肿瘤鼠的生存期及抑瘤率；并取各组小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞的增殖和特异性杀伤淋巴细胞数（CD8+和INF-γ双阳性），乳酸脱氢酶法检测淋巴细胞杀伤作用及ELISA法检测淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ量；由此判定融合蛋白的抗肿瘤作用的效果。结果：(1)成功构建pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表达质粒，经酶切和测序鉴定完全正确。

7、(2)将构建好的质粒转染B16-F1细胞，通过G418筛选后，建立了稳定稳定表达CRT、PD1、CRT-sPD1蛋白的B16/3.1(+)/CRT、B16/3.1(+)/PD1、B16/3.1(+)/CRT-sPD1细胞株及对照细胞株B16/3.1(+)。(3)收集稳定表达分泌性PD-1、CRT及CRT-sPD-1的细胞培养上清，流式细胞仪检测到PD1与CRT-sPD1能与EL4细胞表面的诱导表达的PDL1特异性结合。(4)收集上述的细胞上清刺激脾脏淋巴细胞，发现融合蛋白CRT-sPD-1能够显著的促进淋巴细胞增殖。(5)将上述稳定表达的细胞株与混合淋巴细胞共培