lhx8在海马胆碱能神经再生中所起作用的初步研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人禚导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容岁卜，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不会为获得苏翔大学或其它教育机构的学位证书面使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：’纽。盥一日期：越。丝：&』k。．．苏州大学学位论文使用授权声明[1UllllllllllUllllllllllllllllY2122211本人完全7解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定。即

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3、作用的初步研究中文摘要LIM同源盒基因8(LIMhomeobox8，Lhx8)与胚胎基底前脑胆碱能神经元的发育有关，但Lhx8在中枢胆碱能神经再生及海马齿状回胆碱能神经再生过程中所起的作用尚未见到报道，本研究主要探讨Lhx8在海马胆碱能神经再生中所起的作用。一．目的：体外培养大鼠海马源性放射状胶质细胞(Radialgliacells，RGCs)，观察并检测海马提取液在RGCs增殖和向胆碱能神经元分化过程中所发挥的效用；构建Lhx8过表达载体并经慢病毒包装，转染至体外培养的RGCs，同时注入大鼠海马齿状回中，对Lhx8在海马胆碱能神经再生过程中所起

4、的作用进行初步的探讨。二．方法：(1)切割大鼠右侧穹窿海马伞并且制各正常侧及切割侧海马提取液；(2)体外培养海马源性RGCs，在培养液中加入正常侧及切割侧海马提取液，观察海马提取液对RGCs增殖和向神经元分化方面的作用；(3)联合应用海马提取液及NGF共同促进海马RGCs向胆碱能神经元分化，观察Lhx8在ChAT阳性的神经元中的表达和定位；(4)克隆Lhx8cDNA序列，构建pLenti6．3一Lhx8．IRES2．EGFP表达载体并经慢病毒包装，将收集的慢病毒Lenti6．3．Lhx8转染RGCs，观察RGCs向胆碱能神经元分化的情况，检测Lh

5、x8和ChAT的基因及蛋白的表达变化；(5)将慢病毒Lenti6．3．Lhx8注入正常侧及切割穹窿海马伞侧大鼠海马齿状回中，观察正常侧及切割侧海马齿状回中ChAT阳性的胆碱能神经元的表达和定位，检测Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表达变化。三．结果：(1)RGCs具有典型的双突起形态学特征，同时可表达胶质相关标记物BLBP、GFAP、Vimentin，并且这些胶质相关标记物能与干细胞相关标记物Nestin进行双标，此外RGCs还能够分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞；(2)切割穹窿海马伞侧的海马提取液能够明显促进RGCs的增殖和向神经元分

6、中文摘要Lhx8在海马胆碱能神经再生中所起作用的初步研究化；切割侧海马提取液联合NGF能够促进RGCs向ChAT阳性的胆碱能神经元分化，这些Cl衄阳性的胆碱能神经元能够表达Lllx8；(3)RGCs转染慢病毒Lenti6．3．Lhx8后，分化为MAP2阳性神经元的总体数目没有明显增加，但是能够提高ChAT阳性细胞在MAP2阳性神经元中所占的比例，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表达量也明显增高，说明转染慢病毒Lenti6．3．Lhx8后，能够促进RGCs向胆碱能神经元分化；(4)在正常海马齿状回中注入慢病毒Lenti6．3．Lhx8后，能够明显提

7、高齿状回内ChAT／Lhx8阳性的胆碱能神经元数量；切割穹窿海马伞并联合慢病毒注射后，发现齿状回内ChAT／Lhx8阳性的胆碱能神经元的数量增加更为明显，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表达量也明显增高，说明切割穹窿海马伞并且联合应用Lenti6．3．Lhx8慢病毒可以明显地促进海马内的胆碱能神经再生水平。四．结论：(1)体外培养的海马源性RGCs具有典型的双突起形态学特征，这些细胞能够同时表达胶质细胞相关标记物和干细胞相关标记物。体外应用切割穹窿海马伞侧海马提取液能够较好的模拟切割穹窿海马伞后的海马再生微环境。在RGCs扩增培养阶段切割侧海马提

8、取液能明显地促进RGCs增殖，而在RGCs分化阶段切割侧海马提取液也能够促进RGCs更多地向神经元分化；(2)慢病毒Lenti6．3．L