dkk1基因在肺癌细胞系中表达及其生物学功能的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文DKK1基因在肺癌细胞系中表达及其生物学功能的研究姓名：闫红红申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：周连亚；李书军201203中文摘要DKKl基因在肺癌细胞系中表达及其生物学功能的研究摘要目的：肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害着人类的健康，而目前认为最重要的致癌因素之一就是癌基因与抑癌基因的突变。根据近年来研究成果得出，DKKl基因在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，但其在肺癌中的作用尚不清楚，因此在本实验中将对DKKl基因在肺癌细胞株中的生物学作用进行初步探讨。在本次实验中我们首先利用分子克隆技术构建DKKl的真核细胞表

2、达载体，以此筛选建立稳定转染DKKl表达载体的肺癌细胞株，进而初步探讨DKKl对肺癌细胞株95．C迁移能力及侵袭能力的影响。方法：1应用分子克隆技术，构建PCMV．Tag．2b．DKKl质粒，为后续实验奠定基础。2应用WesternBlot及RT—PCR法验证pCMV—Tag．2b．DKK1转染95C细胞后DKKl蛋白及mRNA表达水平，并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照；3应用划痕试验检测肺癌细胞株95C经转染pCMV．Tag．2b．DKKl后，其迁移能力的改变情况，并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照；4应用BoydenC

3、hamber法测定肺癌细胞株95C经转染pCMV-Tag-2b．DKKl后，其侵袭能力的改变情况，并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照；结果：1应用分子克隆技术成功构建了PCMV．Tag．2b．DKKl真核表达质粒，并经酶切和DNA测序分析得到确认。2分别应用RT．PCR和WesternBlot在95C细胞株中证实了转染pCMV．Tag．2b．DKKl的细胞系成功表达了DKKl蛋白；初步建立了稳定转染95．C-pCMV．Tag．2b．DKK1细胞株；3在95C细胞株中分别转染pCMV．Tag．2b．DKKl及空载体，应用中文摘要划痕试验检测分

4、析发现，转染pCMV．Tag．2b．DKKl48小时后的95．C细胞的抑制率分别为16％，明显低于转染PCMV．Tag．2b组和空白对照组的细胞的抑制率62％和55％(P=O．000)；4在95C细胞株中分别转染pCMV．Tag．2b．DKKl及空载体，应用Boyden小室检测分析发现，转染pCMV—Tag．2b．DKKl的细胞株侵袭穿过基底膜的平均细胞数目为85．92，明显高于转染PCMV．Tag．2b组和空白对照组的侵袭细胞数目22．52和38．37(P=0．ooo)。结论：1成功构建了pCMV．Tag一2b．DKKl真核细胞表达载体，并建立了稳定转染

5、的95．C．pCMV．Tag．2b．DKKl细胞株，为进一步深入研究DKKl的生物学功能奠定了基础：2pCMV．Tag．2b．DKKl转染后使人肺癌细胞株95．C的迁移及侵袭能力增强，提示DKKl可能与肺癌的侵袭转移有关。关键词：DKKl；分子克隆；肺癌；侵袭；转移．英文摘要—————————————————————————————————'一—二——————一一．．ThestudyofDKKlgeneexpressionandbiologicalfunctioninlungcancer‘ABSTRACTObjective：Lungcanceriscons

6、ideredasoneofthemostcommonmalignanttumorsintheworld，whichseriouslyendangerhumanhealth．RecentstudiesshowthatmutationsinoncogenesortumorsuppressorgenesaredirectlyassociatedwithlungcancerofwhichDKKlgenecallbeinvolvedmthedevelopmentandprogression．However，thespecificroleofDKKlinlungcan

7、cerisstillunclear．neaimofthisstudywastoevaluatethebiologic．alfunctionofDI张1inlungcancercell1i11e．Inthisstudy,DKKlexpressionvectorswerebuiltwithmolecularcloningtechniquesandexpressedineukaryoticcells．StablecelllinewasestablishedsubsequentlNthusWemeasuredwhetherDKK1transfectedinto95

8、．Ccellshadimpactonthemigrationort