cell-selex技术筛选急性早期幼粒细胞白血病nb4细胞适配子

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1、第二军医大学硕士学位论文CELL--SELEX技术筛选急性早期幼粒细胞白血病NB4细胞适配子姓名：陈鑫申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：兰小鹏201205CELL．SELEX技术筛选急性早幼粒细胞白血病NB4细胞适配子摘要【目的】利用以细胞为靶标的指数富集配基的系统进化(CELLbasedSystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment，CELL—SELEX)技术，筛选出与急性早幼粒细胞白血病(AcutePromyelocyticLeukemia,APL)NB4活细胞高亲和力高特异性结合的适配子，为荧光标记适配子快

2、速鉴定APL检测方法的建立奠定基础。【方法】1．在体外构建两端为固定序列，中间为40个nt的随机序列，全长76个nt的单链DNA(ssDNA)文库，以NB4细胞作为靶分子，进行CELL—SELEX筛选，同时利用流式细胞仪和荧光显微镜监控FITC．ssDNA次级库与NB4活细胞的结合过程。2．从第二轮开始，每轮引入ssDNA次级库与急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)HL60细胞和慢性髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)K562细胞相结合的反筛策略。3．将结合率(bindingrate，BR)最高的第十六轮筛选产物进

3、行扩增、纯化、TA克隆和测序，并用Dnaman软件分析预测其二级结构。4．用流式细胞仪测定克隆适配子群与NB4活细咆的结合率，选出结合率最高的一个克隆适配子，利用GraphPad．Prism．v4．03软件进行亲和力分析。5．采用TAMRA标记结合率最高的适配子，该适配子与三种白血病细胞相结合后，通过荧光显微镜验证其特异性。【结果】1．随着筛选轮数的增加，ssDNA次级库与NB4活细胞的结合率逐渐增加，第十六轮的结合率(19．9％)是第一轮结合率(1．6％)的12倍；十六轮以后，ssDNA次级库与NB4活细胞的结合率不再增加。2．选取结合率最高的第十六轮筛选的克隆适配子群进行测序，

4、发现21个克隆适配子序列中有3种不同序列，16个克隆子序列为：CXl，3个克隆子序列为：CX5，2个克隆子序列为：CX9，预测分析适配子的二级结构以茎一环结构为主。第二军医大学硕士学位论文3．克隆适配子CXl、CX5和CX9分别与NB4活细胞结合反应，流式细胞仪检测的结合率分别为：9．7％、12．6％、17．2％；适配子CX9结合率最高。4．分析适配子CX9与NB4活细胞结合的亲和力，其解离常数(Kd)值低至16．2nM。5．TAMRA标记的适配子CX9与NB4活细胞结合后，通过荧光显微镜可观察到明亮、数量较多的红色荧光，而与HL60和K562混合细胞结合后，未见明显的荧光信号。【

5、结论】本研究经过十六轮CELL．SELEX筛选，获得针对NB4活细胞的ssDNA适配子，流式细胞仪和荧光显微镜分析表明筛选出的适配子CX9结合NB4活细胞具有高亲和力和高特异。高亲和力、高特异性针对NB4活细胞适配子的成功筛选，可为急性早幼粒细胞白血病的靶向诊治和基础研究奠定基础。【关键词】CELL．SELEX，适配子，NB4细胞，白血病，急性早幼粒细胞白血病2CELL．SELEX技术筛选急性早幼粒细胞白血病NB4细胞适配子Abstract[Objective]Toscreenaptamersbindingtoacutepromyelocytieleukaemia(APE)NB4l

6、ivingcellswithhighaff'mityandspecificitythroughCELLbasedSystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment(CELL-SELEX)andlayafoundationfortherapiddiagnosticmethodtodetectAPL、Ⅳitllfluorescence—labeledaptamer．[Methods]1．Fromatotallengthof76ntsingle—s仃andedDNA(ssDNA)librarycontainingbothendsofaf

7、ixedsequenceandthemiddle40ntofrandomsequence，aptamersagainstNB4cellswerescreenedthroughCELL-SELEX．AndthebindingbetweenFITC—ssDNAlibraryandNB4livingcellswasmonitoredusingflow-cytometryandfluorescencemicroscope．2．Ineachroundafterthesecond