afmnpv诱导凋亡sl-1细胞中凋亡体的研究

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1、华中师范大学硕士学位论文AfMNPV诱导凋亡SL--1细胞中凋亡体的研究姓名：宋娜申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：彭建新201205⑨硕士学位论文MASTER’STHESIS摘要细胞凋亡是多细胞动物中一种进化上保守的，用来清除衰老损伤细胞的一种机制。对于哺乳动物细胞中凋亡信号通路的研究，已经比较清楚，研究表明主要存在外源性信号通路和内源性信号通路。其中在内源性信号通路中，线粒体通过释放像细胞色素C(cytochromec)这样的死亡因子来执行细胞凋亡。cytochromeC一旦从线粒体中释放出来便会

2、同Apaf-1结合并在dATP的参与下募集procaspase一9(形成凋亡体)导致其活化，并引发随后的效应caspase活化的级联反应，其中凋亡体起着重要的作用。我们以前的研究表明芹菜夜蛾核型多角体病毒(AfMNPV)能诱导鳞翅目斜纹夜蛾S1-1细胞发生凋亡，并发现在凋亡过程中会出现线粒体膜电位降低，cytochromeC从线粒体释放至细胞质基质的现象，表明其凋亡信号通路同哺乳动物线粒体信号通路相似。为了进一步阐明Af／VINPV或放线菌素D诱导SL-1细胞凋亡的凋亡机制，本文对AfMNPV或放线菌素D在诱导SL-1

3、细胞凋亡过程中，线粒体信号通路中组成凋亡体的各个组分进行了初步探究。运用westernBlot技术检测到了SL一1细胞中组成凋亡体的三种组分：Apaf一1，caspase一9和cytoc}们mec，运用Co—IP技术发现了Apaf-1同caspase-9之间的相互作用，并测定了caspase酶活性等，初步探究了凋亡体的抑制剂5’对氟磺酰苯甲酰腺苷盐酸盐(FSBA)对杆状病毒或放线菌素D诱导SL-1细胞凋亡的影响。1、AfMNPV或放线菌素D诱导SL-1细胞凋亡过程中凋亡体各个组分的表达情况及caspase酶活性分析通过

4、WesternBlot结果显示，AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡6h时细胞质中Apaf-1的含量会升高，procaspase-9的含量由于活化而降低，并且随着时间的延长而逐渐降低；cytocl啪meC会从线粒体中释放出来导致其含量升高。放线菌素D处理组的结果同AfMNPV类似，不同之处是procaspase一9会在处理后6h表达量升高，随后才下降。通过Co-IP技术可以检测到在AflANPV(或放线菌素D)诱导SL-1细胞凋亡12h时Apaf-1和procaspase-9的相互作用。通过对SL-1细胞凋亡过程中casp

5、ase一9，caspase一3酶活性的测定发现，AfMNPV(或放线菌素D)在诱导SL-1细胞凋亡过程6h均能出现caspase-9，caspase-3活化的现象。caspase-9的酶活力随着时间的延长而缓慢升高。AfMNPV处理组的caspase-3酶活在18h时还有较高的酶活力，放线菌素D处理组caspase-3酶活则⑨硕士学位论文MASTER’STHESIS在6h和12h时较高。2．FSBA对AfMNPV或放线菌素D诱导的SL-1细胞凋亡的抑制作用FSBA是凋亡体抑制剂，细胞在最终浓度为50州、100州和200

6、蹦FSBA存在条件下，AfMNPV或放线菌素D诱导的SL-1细胞凋亡，细胞经DAPI染色，显微观察发现，不同浓度的FSBA均能抑制杆状病毒或放线菌素D诱导的细胞凋亡。流式细胞术检测显示FSBA抑制杆状病毒或放线菌素D诱导的细胞凋亡具有浓度依赖性，且主要抑制细胞凋亡的晚期细胞凋亡的进程。caspase-3酶活力的分析表明，FSBA能够明显抑制AfMNPV或放线菌素D诱导的SL一1细胞凋亡过程中的caspase一3酶活性。这些研究表明在杆状病毒或放线菌素D诱导的SL-1细胞凋亡过程中，涉及凋亡体的形成和它介导的caspas

7、e级联反应。关键词：细胞凋亡；杆状病毒；放线菌素D；Caspasc；凋亡体；FSBAⅡAbstractInmulti—cellularanimals，apoptosisisallevolutionarilyconservedmechanismusedtoremovetheagingdamagecells．Cellapoptosissignalingpathwayshavebeenrelativelyclearlyresearchedinmammaliancells，andresearchhaveshownthatthe

8、remainexistestwosignalingpathways：exogenoussignalingpathwaysandendogenoussignalingpathways．Intheendogenoussignalingpathway,mitochondriareleasesthedeathfactor(suchascy